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Etudes de deux protéines chaperonnes des acides nucléiques de virus de l’immunodéficience humaine type 1 : Vif et la protéine nucléocapside / Studies of two chaperone proteins acids nucleic in human immunodeficiency virus type 1 : Vif protein and nucleocapsid proteinAkil, Dona 18 January 2013 (has links)
Le travail de ma thèse porte sur l’étude des protéines chaperonnes des acides nucléiques chez le virus de l’immunodéficience humaine VIH-1.Ces protéines sont au nombre de trois : Tat, Vif et la Nucléocapside. Je me suis concentrée sur les deux dernières citées : Vif, dont j’ai réalisé une étude structurale et fonctionnelle en partant du gène, j’ai réussi à produire et purifier la protéine, que je l’ai caractérisée par des méthodes structurales comme la diffusion de lumière et le dichroïsme circulaire. J’ai étudié les interactions de cette protéine avec les acides nucléiques par spectroscopie de fluorescence et Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Et finalement j’ai participé aux tests d’activités chaperonnes. Pour la nucléocapside, qui est une protéine déjà connue au sein du laboratoire, j’ai examiné son rôle de protéine chaperonne lors de l’initiation de la transcription inverse. J’ai mis en évidence par RMN une interaction très controversée entre l’ARN génomique virale et l’ARNtLys3 qui joue le rôle d’amorce pour l’initiation de la transcription inverse. / Pas de résumé en anglais
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Determination of the secondary structure of minus strong-stop DNA and the mechanism of annealing involved in the first strand transfer in HIV-1 / Analyse structurale et fonctionnelle du premier transfert de brin chez le VIH-1Chen, Yingying 14 September 2012 (has links)
Le 1er transfert de brin, étape cruciale de la transcription inverse impliquant la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC), repose sur l’appariement de la séquence r de l’ADN « strong stop » (ADNss) avec la séquence 3’ R de l’ARN viral (3’UTR) qui forme les tiges-boucles TAR et polyA. La séquence r est supposé former les tiges-boucles cTAR et cpolyA. Le transfert repose donc probablement sur l’hybridation de molécules structurées. La structure secondaire de l’ADNss n’a jamais été déterminée. L’objectif a été d’identifier les interactions et structures gouvernant l’hybridation de l’ADNss avec l’ARN 3’UTR. Les outils de la biologie moléculaire et trois sondes de structure ciblant l’ADN ont été utilisés pour atteindre cet objectif. Nos résultats sont les suivants : 1) l’ADN cTAR nu se replie sous la forme de deux conformations différentes qui sont en équilibre ; 2) la NC peut déplacer l’équilibre vers l’une des conformations et se fixer préférentiellement sur la boucle interne du cTAR ; 3) la NC est exigée pour former un hétéroduplex constitué de l’intégralité de l’ADNss et du 3’ UTR ; 4) l’hybridation ADNss-3’UTR peut être initiée à partir de plusieurs sites dans 0,2 mM MgCl2 ; 5) l’ADNss forme deux conformations en équilibre dans 0,2 mM MgCl2 et principalement une seule dans 2 mM MgCl2 ; 6) dans l’ADNss, la NC se fixe préférentiellement au niveau de la région simple-brin qui relie les tiges-boucles cTAR et cpolyA. Cette fixation joue probablement un rôle important dans l’hybridation des tiges-boucles ARN et ADN complémentaires. Notre étude permet de mieux comprendre la transcription inverse et la recombinaison qui dépend du transfert de brin interne. / The 1st strand transfer, a crucial step of reverse transcription involving the HIV-1 nucleocapsid protein (NC), relies on base pairing of the r sequence of strong-stop DNA (ssDNA) with the 3’ R sequence of viral RNA (3’ UTR) which forms the TAR and polyA stem-loops. The r sequence can form the cTAR and cpolyA stem-loops. Therefore, the transfer relies probably on annealing of folded molecules. This process is not well known at the molecular and structural level. The tools of molecular biology and three DNA-targeted probes were used to get insights into the annealing process. Our results were the following: 1) in the absence of NC, the cTAR DNA folds into two distinct conformations in equilibrium; 2) NC slightly shifts the equilibrium toward one conformation and binds tightly the internal loop of the cTAR hairpin; 3) NC is required for the formation of heteroduplex of the full-length ssDNA and 3’ UTR; 4) the annealing of ssDNA to 3’ UTR can be initiated from different sites in the presence of 0.2 mM MgCl2; 5) the full-length ssDNA folds into two conformations in equilibrium in 0.2 mM MgCl2 but mainly into one conformation in 2 mM MgCl2 ; 6) NC preferentially binds to the single-stranded region between the cTAR and cpolyA hairpins in ssDNA. This binding site probably plays an important role in the annealing of complementary DNA and RNA hairpins. This study helps us to gain insights into the reverse transcription process and the associated genetic recombination.
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