La protéine multifonctionnelle p54nrb est impliquée dans le contrôle transcriptionnel couplée aux phénomènes de maturation des ARN messagers. La transcription et l'épissage sont inhibés en mitose et la phosphorylation de nombreux facteurs participe à ce phénomène. Dans le laboratoire, il a été montré que p54 est hyperphosphorylée en mitose et interagit de façon phosphodépendante avec le régulateur mitotique Pinl (enzyme qui isomérise un lien proline précédé d'un site phosphoryle Thréonine/Sérine). Le rôle de cette interaction est méconnu mais permet de dire que p54 est régulé par phosphorylation en entrée de mitose. La protéine p54 est diffuse dans le nucléoplasme et est également concentrée avec ses partenaires PSF et PSP1 dans les paraspeckles, des compartiments nucléaires à structure dépendante d'un ARN non codant NEAT1. Il a été récemment montré qu'une association entre l'ARN qui structure les paraspeckles et p54nrb permet de maintenir l'intégrité de ces compartiments. Étant donné l'implication de p54nrb dans de nombreux procédés majeurs, l'objectif de ma thèse a été de comprendre le rôle de la phosphorylation mitotique de p54nrb. La localisation, les interactions protéiques et les propriétés de liaison à l'ARN ont été étudiées. Ces expériences ont permis de conclure que p54nrb reste en complexe avec les protéines PSF et PSP1 mais perd son affinité de liaison à l'ARN en mitose via la phosphorylation d'un résidu en amino-terminal (T15). Par contre, la liaison aux homoribopolymères de Guanine (G) ainsi qu'avec l'ARN non codant NEAT1 (riche en G) ne sont pas compromises par la phosphorylation mitotique. Ces résultats ont permis d'établir de nouvelles propriétés fonctionnelles pour la protéine p54nrb. Par ailleurs, j'ai aussi voulu caractériser la phosphatase responsable de sa déphosphorylation en fin de mitose et les premiers résultats impliquent l'action de la phosphatase PPL De plus, le rôle de l'interaction entre Pinl et p54nrb a été étudié dans la possibilité que Pinl puisse être impliqué dans le processus de déphosphorylation de p54nrb. En conclusion, l'ensemble des travaux de cette thèse a permis de mieux caractériser les fonctions de la protéine multifonctionnelle p54nrb notamment dans le cadre de sa phosphorylation mitotique.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / p54nrb est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire impliquée dans plusieurs processus cellulaires tels que la transcription, la maturation des ARNm et la rétention des ARNs hyper-édités. Cette protéine multifonctionnelle fait partie de la machinerie d'épissage et participe à ce processus en liant directement le site d'épissage en 5' du pré-ARNm. De plus, p54nrb se concentre dans un corps nucléaire nommé le paraspeckle en liant une fraction riche en G de l'ARNnc NEAT1. Récemment, nous avons démontré que la phosphorylation mitotique de la threonine 15 de p54nrb, située en N-terminal de deux RRMs en tandem, régule négativement sa capacité de liaison aux ARNs excepté pour ceux riches en G comprenant l'ARNnc NEAT1 (Bruelle et al., sous presse, annexe A). Afin de caractériser la liaison des différents RRMs de p54nrb à l'ARN, une dissection moléculaire de son domaine de liaison à l'ARN (DLA) a été réalisée. Cette section contient les deux RRMs de la protéine précédés d'une région riche en H, Q, et P contenant le résidu T15 phosphorylable. Des tests de liaison in vitro à l'ARN du site d'épissage en 5' (5'SS, 11 nucleotides) et à des ARNs de polyguanosines ont permis de démontrer que le RRM1 de p54nrb est responsable de l'affinité de la protéine pour ces ligands. De plus, la cartographie des sites d'interaction du RRM1 avec le 5'SS et avec un ARN de polyguanosines (polyG, 11 nucleotides) a été réalisée par RMN et a révélé un site de liaison unique pour chacune de ces molécules. En effet, nous avons démontré que le RRM1 de p54nrb lie l'ARN polyG par un site de liaison non classique différent du site de liaison classique utilisé par la protéine pour lier le 5'SS. Ces expériences ont aussi permis de voir que le RRM1 de p54nrb avait plus d'affinité pour le polyG que pour le 5'SS. Les résultats obtenus démontrent pour la première fois, à notre connaissance, la possibilité pour un seul RRM de posséder deux sites distincts de liaison à l'ARN. De plus, cette liaison non classique du RRM1 de p54nrb aux ARNs de polyguanosines pourrait potentiellement expliquer pourquoi la liaison de la protéine à ce type d'ARN n'est pas affectée par sa phosphorylation.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La protéine multifonctionnelle p54nrb , enrichie dans un nouveau domaine nucléaire nommé paraspeckles, fait partie de complexes de transcription/épissage comprenant l'ARN polymérase II et son partenaire PSF. Des travaux récents effectués dans notre laboratoire montrent que p54nrb est phosphorylée en mitose (Proteau A., Blier S., Albert A.L., Lavoie S.B., Traish A. M. and Vincent M. (2005) J. Mol. Biol. 346, 1163-1172). La phosphorylation est une modification post-traductionnelle pouvant affecter la localisation cellulaire d'une protéine, ses interactions, sa dégradation et son activité. Pour étudier l'impact de la phosphorylation mitotique de p54nrb , sa localisation cellulaire a été comparée en interphase et en mitose par immunofluorescence indirecte. Les résultats ont montré que la phosphorylation ne semble pas affecter sa localisation aux paraspeckles en mitose. Ensuite, ses interactions dans le complexe transcription/épissage ont été vérifiées en mitose par immunoprécipitation et pulldown. Les résultats ont montré que la phosphorylation ne semble pas affecter le complexe p54nrb-PSF-ARN polymérase II en mitose in vitro. Des analyses biochimiques ont finalement montré que la phosphorylation de p54nrb ne semble pas non plus empêcher son association à la matrice nucléaire. L'étude antérieure, citée précédemment, a également montré que p54nrb est reconnue par la peptidyl-prolyl isomérase Pinl en mitose. La juglone, un inhibiteur enzymatique de Pinl, a été utilisée pour évaluer l'effet de l'interaction de Pinl sur le niveau de phosphorylation de p54nrb . Les résultats ont montré que l'inhibition de Pinl empêche la déphosphorylation de p54nrb à la fin de la mitose ainsi que celle de PSF, nouveau substrat de Pinl. La protéine Pinl pourrait réguler chaque membre du complexe p54nrb-PSF-ARN polymérase II à la reprise du cycle cellulaire.