Si en transcriptomique le dogme accepté par la communauté veut qu’un ARNm code pour une protéine unique, la protéomique vient de montrer l’inverse. Force de constater que les ARNm peuvent traduire plusieurs protéines. Celles ne suivant pas le cadre de référence sont appelées protéines alternatives (AltProts) et forme le protéome caché ou fantôme. Ces AltProts nécessitent la mise en place de stratégies adaptées pour leur mise en évidence. Leurs caractéristiques physicochimiques spécifiques, telles que leur petite taille permet d’adapter les méthodes classiques de protéomique à leur étude. Dans cet objectif la mise en évidence des AltProts par différentes méthodes d’extraction, notamment adaptées des méthodes de peptidomique, a permis de mettre en évidence les conditions d’enrichissement avant une analyse bottom-up. Ces AltProts sont une nouvelle classe de protéines pour laquelle très peu d’informations fonctionnelle sont connues. Les prédictions de fonction avancées lors des premières constructions de base de données, annonçaient des fonctions dans la régulation des ARN, de la synthèse de protéines et de la régulation d’expression des gènes par association avec des facteurs de transcriptions. Ces prédictions étaient basées sur les homologies de séquences entre les AltProts et les protéines de références (RefProts). Cependant très peu d’études montrent le rôle de ces protéines de manière expérimentale. Afin de mettre en évidence les fonctions de ces AltProts, nous avons choisi de retrouver leurs partenaires d’interaction. À l’heure actuelle, plusieurs méthodes existent permettant d’étudier l’interactome des protéines, toutefois la majorité est dirigée vers une cible, nécessitant parfois des constructions biochimiques ou l’utilisation d’anticorps dirigés, rendant ces méthodes difficiles à mettre en place pour les AltProts. Seule la méthode de Crosslink couplée à la spectrométrie de masse (XL-MS) permet d’observer des interactions cellulaires de manière non ciblée. Cette méthode de pontage chimique, bien que connaissant ses propres limitations, est applicable à la recherche des partenaires d’interaction des AltProts. Cet outil, associé aux logiciels de traitement des réseaux d’interaction, enrichi par les interactions connues entre RefProts dans la littérature, permet de replacer les AltProts dans ces réseaux. Ces réseaux, peuvent ensuite être traités afin de mettre en évidence les voies de signalisation impliquant les RefProts et ainsi déduire les différentes voies de signalisation associées aux AltProts observées crosslinkées aux RefProts. / In transcriptomics the dogma accepted by the community is that a single mRNA codes for a single protein, proteomics has just shown the opposite. It must be said that mRNAs can translate several proteins. These not following the reference framework are called alternative proteins (AltProts) and form the hidden or ghost proteome. These AltProts require the implementation of appropriate strategies to highlight them. Their specific physicochemical characteristics, such as their small size, make it possible to adapt classical proteomic methods to their study. With this objective in mind, the identification of AltProts by different extraction methods, particularly adapted to peptidomic methods, made it possible to highlight the enrichment conditions before a bottom-up analysis. These AltProts are a new class of proteins for which very little functional information is known. Advanced function predictions in the early database constructions announced functions in RNA regulation, protein synthesis and gene expression regulation by association with transcriptional factors. These predictions were based on sequence homologies between AltProts and reference proteins (RefProts). However, very few studies show the role of these proteins in an experimental way. In order to highlight the functions of these AltProts, we have chosen to find their interaction partners. At present, several methods exist to study the protein interactome, however the majority are directed towards a target, sometimes requiring biochemical constructs or the use of directed antibodies, making these methods difficult to implement for AltProts. Only the Crosslink method coupled with mass spectrometry (XL-MS) allows to observe cellular interactions in a non-targeted way. This chemical bridging method, although aware of its own limitations, is applicable to the search for AltProts interaction partners. This tool, combined with the software for processing interaction networks, enriched by the known interactions between RefProts in the literature, makes it possible to replace AltProts in these networks. These networks can then be processed to highlight the signaling pathways involving RefProts and thus deduce the different signaling pathways associated with the observed AltProts crosslinked to the RefProts.

La vision traditionnelle de la synthèse protéique chez les eucaryotes comprend un ARN messager (ARNm) qui porte un seul cadre de lecture ouvert (ORF). Chaque gène codant eucaryote produit généralement une protéine canonique et éventuellement une ou plusieurs isoformes. Cependant, de nombreuses évidences expérimentales récentes démontrent que le protéome des eucaryotes a été sous-estimé, et que les cellules sont capables de synthétiser des protéines qui n’étaient jusqu’alors pas prédites. Ces nouvelles protéines « alternatives » (altProts) peuvent être issues de la traduction d’ORFs non annotés contenus sur des ARNms, ou des ARNs non codants. Ces découvertes ont été possibles grâce aux progrès techniques réalisés en biochimie analytique en protéomique par spectrométrie de masse. Dans le cadre de ces analyses, deux approches sont privilégiées. La première, ou bottom-up se base sur les produits peptidiques issus d’une digestion enzymatique des protéines quand la seconde ou top-down est basée sur la mesure des protéines entières. Les travaux réalisés dans cette thèse s’articulent autour du développement de stratégies pour la découverte et la caractérisation des altProts par approches protéomiques bottom-up et top-down. Ces aspects sont décrits dans plusieurs publications scientifiques qui seront présentées dans ce manuscrit. Elles comprennent une revue de bibliographie, deux publications relatives à l’application de l’approche top-down par micro-extractions de tissus de cerveau de rat et de biopsie tumorale ovarienne et une publication relative à la détermination de la stœchiométrie de deux protéines, l’une alternative et l’autre canonique toutes deux issues du même gène. / The traditional view of protein synthesis in eukaryotic species involves one messenger RNA (mRNA) bearing a single open reading frame (ORF). Thus, each eukaryotic coding gene may produce one canonical protein and possibly one or more of its isoforms. However, numerous experimental evidence report that eukaryotic proteomes may have been under-estimated and that cells are capable of synthetizing proteins which had not been predicted thus far. These novel proteins, termed “alternative proteins” (altProts) may be translated from non-canonical ORFs localized in mRNAs or from RNAs annotated as non-coding. These discoveries were made possible thanks to technical progresses in analytical chemistry in mass spectrometry-based proteomics. These analyses are based on two main strategies; the “bottom-up” approach is based on the peptidic products of enzymatic digestion of native proteins whereas the second and more recent approach, termed “top-down”, is based on the analysis of intact protein by mass spectrometry. The work described in this thesis is focused on the development of experimental strategies helping the discovery and characterization of altProts using bottom-up and top-down approaches. The findings are described in scientific publications which are included in the thesis. These publications include a review, two publications on the application of the top-down approach using micro-extractions on rat brain tissue and ovarian tumor biopsy and one publication related to the stoichiometry elucidation of a canonical and an alternative protein both encoded within the same gene.

Contrairement à la vision classique des ARNms eucaryotes qui ne contiendrait qu’une seule séquence codante, de nombreuses évidences expérimentales montrent que ces ARNms contiennent plusieurs séquences codantes qui permettraient l’expression de plusieurs protéines différentes. Les ARNms sont donc multicodants et contiennent des cadres de lectures alternatifs (AltORFs pour alternative open reading frames). Ces ORFs alternatifs sont présents dans les régions non-traduites (UTRs) ou chevauchant le RefORF (cadre de lecture ouvert de référence) dans les cadres de lectures non-canoniques +2 et +3. Le protéome est donc plus complexe que ce que l’on pense. Toutefois, le rôle et la fonction de ces nouvelles protéines restent à être investigués. Au cours de mon projet de recherche à la maîtrise, j’ai commencé la caractérisation de la protéine alternative AltMiD51, codée dans le 5’UTR du gène bicistronique MIEF1/SMCR7L/MID51 et co-exprimée avec sa protéine de référence MiD51. Par des approches variées de biologie moléculaire, cellulaire et biochimique, j’ai d’abord démontré et confirmé la localisation cellulaire de la protéine AltMiD51 à la mitochondrie. Par la suite, j’ai pu démontrer que la présence d’AltMiD51 affecte significativement la morphologie mitochondriale en fragmentant celle-ci. De plus, j’ai pu davantage cibler la région qui contient l’information de sa localisation ainsi que son effet de fragmentation, soit seulement les 23 premiers acides aminés de sa séquence. J’ai également observé que cette région Nterminale (a.a.23) est encore plus efficace pour induire la fragmentation des mitochondries. J’ai pu démontrer que le motif protéique L-Y-R est essentiel pour l’activité de fragmentation. J’ai également validé l’interaction in vivo de AltMID51 avec sa protéine partenaire ACPM (Acyl carrier protein) dans des foci mitochondriaux. En conclusion, mes travaux à la maîtrise ont permis de mettre en évidence que la protéine AltMiD51 est un nouveau facteur impliqué dans la fission mitochondriale. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives en ce qui concerne la caractérisation de nouvelles protéines alternatives et par leur contribution dans la biologie moléculaire de la cellule. / Abstract : Challenging the dogma that eukaryotic mRNAs contain a single coding sequence, an ever-growing number of studies highlight the possibility for these mRNAs to have several coding sequences, and thereby code for multiple proteins. Thus, eukaryotic mRNAs are multicoding and present alternative open reading frames (AltORFs). These alternative ORFs are present in the non-translated region (UTRs), and within or overlapping the RefORF (reference open reading frame) in non-canonical frames (+2 and +3). The proteome is indeed more complex than we initially thought. However, the role and biological function of these proteins remain to be elucidated. Over the course of my MPhil, I started characterizing the alternative protein AltMiD51, encoded in the 5’UTR of the bicistronic MIEF1/SMCR7L/MID51 gene, and coexpressed with its reference protein (MiD51). Using a wide range of molecular biology, cellular and biochemistry assays, I first demonstrated AltMiD mitochondrial localisation. I then proved AltMiD51 expression alters mitochondrial dynamics, enhancing a fragmented morphology. Moreover, I further characterized the sequence region responsible for AltMiD51 localisation and mitochondrial fragmentation, namely the first 23 amino acids. I also observed that this N-terminal region alone presents a stronger phenotype of mitochondrial fragmentation. In addition, I proved the L-Y-R domain is essential for AltMiD51 fragmentation activity, and I validated AltMiD51 in vivo interaction with ACPM (Acyl Carrier Mitochondrial Protein) within mitochondrial foci. Eventually, the work presented here highlighted AltMiD51 as a novel factor involved in mitochondrial fragmentation. These results shed light on new perspectives regarding the characterisation of alternative proteins and their contribution to the cellular metabolism.