Lors de ce travail, une étude comparative entre trois souches de C. glutamicum a été réalisée. Celles-ci sont C. glutamicum 2262, une souche surproductrice de glutamate suite à l’élévation de température du milieu de culture de 33 à 39°C, C. glutamicum 2262 NP un variant incapable d’excréter du glutamate dans ces mêmes conditions et C. glutamicum 2262 ∆pks13 un mutant dépourvu de bicouche mycolique externe. Un modèle métabolique original reprenant les différentes modifications physiologiques aboutissant à l’excrétion du glutamate au cours du procédé thermo-induit a été établi. La bicouche mycolique joue un rôle primordial puisque son absence affecte sévèrement la production du glutamate. Dans un premier temps, l’élévation de température serait ressentie au niveau de cette bicouche. Ce ressenti, visualisé par l’accumulation de protéines caractéristiques d’un stress thermique, est nécessaire pour que la bactérie soit en capacité de surproduire le glutamate. Par la suite, la production de glutamate est régulée au niveau de l’α-cétoglutarate déshydrogénase (ODH) grâce à la phosphoprotéine OdhI. Suite au changement de température, celle-ci est déphosphorylée ce qui lui permet d’interagir avec ODH et de provoquer l’inhibition de cette dernière. Ceci se traduit par la redirection sur flux carboné vers la synthèse du glutamate. Aucun de ces évènements n’est observé chez C. glutamicum 2262 ∆pks13. Par ailleurs, l’élévation de température induit une modification de la composition de l’enveloppe cellulaire qui semble intervenir dans le processus physiologique aboutissant à l’excrétion du glutamate puisque très peu de changements sont observés chez C. glutamicum 2262 NP / During this work, a comparative study between three strains of Corynebacterium glutamicum was carried out. These strains were C. glutamicum 2262 which overproduces glutamate after an increase in the culture temperature from 33 to 39°C, C. glutamicum 2262 NP which is unable to produce glutamate in the same culture conditions and C. glutamicum 2262 ∆pks13 devoid of outer corynomycolic acid bilayer. An original metabolic model describing the successive physiological modifications responsible for the glutamate excretion during the temperature-triggered process was established. The presence of the corynomycolic acid bilayer appeared to be necessary since its lack affected dramatically the glutamate production. The temperature increase would be first sensed at the level of the external corynomycolic acid layer. This sensing was visualised through the accumulation of thermal stress proteins. In C. glutamicum 2262 ∆pks13, the synthesis of these proteins was not induced. The glutamate production is regulated at the oxoglutarate dehydrogenase (ODH) level by the phosphoprotein OdhI. A consequence of the temperature increase was the dephosphorylation of this regulatory protein and its interaction with ODH, provoking its inhibition. The carbon flux was then reoriented toward the glutamate synthesis. In C. glutamicum 2262 ∆pks13, no dephosphorylation of OdhI and no change in the ODH activity were not determined. The thermal stress also induced a change in the composition of the corynomycolic acid layer which was correlated with the ability of C. glutamicum 2262 to overproduce glutamate. In C. glutamicum 2262 NP, the composition of the corynomycolic acid layer remained unchanged

Notre équipe vient de découvrir une méthode originale d’obtention d’extraits de Bacteroides thetaiotaomicron (E) qui préserve sa viabilité. Après culture anaérobie de ce commensal intestinal en milieu gélosé pauvre en facteurs de croissance, puis exposition à l’air, la bactérie semble posséder et générer dans E tout l’équipement de détoxication des espèces réactives de l’oxygène in vitro. Il laisse alors augurer d’un pouvoir thérapeutique à visée anti-inflammatoire.Objectifs et méthodes : Le but est d’abord de caractériser E, aux plans glucidique, lipidique et protéique. Dans ce dernier cas, il s’agit de séparer les protéines produites par la bactérie vivante et contenues dans E par électrophorèse bidimensionnelle et de les identifier par la technique des cartes peptidiques massiques. Les gels (n≥6) sont traités statistiquement (PDQuest®, Bio-Rad). Pour mieux localiser ces protéines dans la bactérie, elles sont comparées avec celles obtenues par destruction de B. thetaiotaomicron et identifiées dans la fraction cellulaire relative à la membrane bactérienne externe. Un travail de microscopie électronique est aussi entrepris pour visualiser les éventuels évènements intervenant pendant l’extraction.Le but est alors de vérifier, in vitro, l’effet antioxydant de l’extrait bactérien standardisé et d’en contrôler l’innocuité en modèles cellulaires utilisant le granulocyte neutrophile. L’effet thérapeutique anti-inflammatoire est ensuite recherché chez l’animal. L’action de E est d’abord évaluée en modèle murin d’inflammation cutanée auriculaire induite par dépôt de chlorure de benzalkonium, sous anesthésie générale. Des témoins positifs et négatifs de traitement et d’autres ne subissant pas d’irritation sont testés en parallèle. L’épaisseur des oreilles est mesurée toutes les heures pendant 5 h et des coupes histologiques d’oreilles, effectuées au bout de 2 h chez certains animaux. Deux colorations différentes permettent alors d’évaluer la quantité de mastocytes dégranulant localement.L’action de E, administré par voie intra-rectale (IR), est ensuite testée chez des souris subissant les premières phases d’un processus inflammatoire, en modèle de colite aiguë. Celle-ci est induite per os par du dextran sulfate sodium (DSS) ; elle évolue sur 8 jours. Sont considérés en parallèle des témoins positifs et négatifs de traitement et d’autres ne subissant pas de colite. Des scores cliniques et des scores histologiques de sévérité sont établis tous les jours de l’expérience. Des marqueurs de l’inflammation sont suivis dans les tissus murins après autopsie des animaux. [...] / Our team had discovered a new method to obtain extracts of Bacteroides thetaiotaomicron (E) which preserved its viability. This intestinal symbiont was anaerobically grown on an agar medium poorly supplemented in growth factors. After exposure to air, the bacterium seemed to possess and generate in E all the equipment able in vitro to detoxify reactive oxygen species. It let us expect a therapeutic power referred to anti-inflammatory properties.Objectives and methods: The aim was first to characterize E, in terms of carbohydrates, lipids and proteins. To achieve this last-mentioned goal, proteins contained in E coming from living bacteria were separated by two-dimensional electrophoresis and identified by the peptide mass fingerprinting technique. The gels (n ≥ 6) were statistically analyzed (PDQuest®, Bio-Rad). To find the origin of these proteins in bacteria, they were compared with those obtained by destruction of B. thetaiotaomicron (BT) and identified in the cell fraction containing the bacterial outer membrane proteins. Electron microscopy work was also undertaken to visualize any event occurring during extraction.The antioxidative effect of standardized E extracts was checked in vitro. E safety was also controlled in cell models using polymorphonuclear neutrophils. An E anti-inflammatory effect was then searched in animal models. E was first evaluated using a skin irritation mouse model. Inflammation was induced by benzalkonium chloride on ears of anesthetized mice. Positive and negative controls were treated in parallel. The ear thickness was measured every hour for 5 h and histological ear sections were performed after 2h for some animals. Two different staining methods enabled the enumeration of degranulating mast cells in ear sections.The effect of the bacterial extract was next tested locally by intrarectal (IR) instillations in mice undergoing the early stages of inflammation in a dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. This acute model evolved over 8 days. In parallel, positive and negative animal controls underwent or not the colitis and were treated or not. Clinical and colonic histological severity scores were daily determined. Inflammation markers were measured in mouse colonic tissues after animal autopsy. [...]