La spectrométrie de masse est une méthode d’analyse qui permet de travailler sur une large gamme d’échantillons. Elle est utilisée dans de nombreux domaines de recherche comme la chimie analytique, la protéomique, la lipidomique et la métabolomique…Dans un premier temps, mon travail s’est focalisé sur le développement d’une méthode indépendante d’analyse de données par spectrométrie de masse à transformée de Fourier bidimensionnelle. Pour augmenter la résolution en première dimension, une analyse FT-ICR 2D avec un échantillonnage non uniforme (NUS) a été développée. L’augmentation de la résolution dans la première dimension a permis l’obtention d’une haute résolution pour les ions précurseurs. La FT-ICR 2D a été utilisée avec succès pour l’analyse de triacylglycérols contenus dans du plasma mais aussi pour l’analyse d’échantillons archéologiques.Dans un second temps, une stratégie protéomique conjointe bottom-up et top-down a été appliquée à l’analyse d’échantillons archéologiques et paléontologiques à partir d’ossements ou de céramiques. Le développement d’une méthodologie bottom-up, a permis à partir d’ossements archéologiques d’espèces inconnues l’identification des protéines et leurs modifications chimiques. Cet ossement a pu être attribué comme appartenant à l’espèce Homo sapiens. Une analyse top-down a été utilisée pour l’analyse d’échantillons archéologiques. Pour la première fois, une protéine (la caséine de lait) a été identifiée dans un échantillon archéologique d’amphore de l’époque de l’empereur Claude (1er siècle de notre ère) grâce la détection de grands fragments de caséine. / Mass spectrometry is a method of analysis which works on a wide range of sample types. It is used in many research fields such as analytical chemistry, proteomics, lipidomics and metabolomics...Firstly, my work was dedicated to the development of an independent data analysis methodology based on two-dimensional Fourier transform mass spectrometry. For increasing the resolution on the first dimension a 2D FT-ICR analysis with non-uniform sampling was developed. The resolution increase in the first dimension leading to high resolution for the precursor ions. The 2D FT-ICR has been successfully applied for the analysis of triacylglycerol contained on plasma and also for archaeological samples. This methodology led to 2D maps allowing a rapid classification of plants or animals samples.Secondly, a joint bottom-up and top-down proteomics strategy was applied for the analysis of archaeological and paleontological samples from bones or ceramics. The development of a bottom-up methodology, allowed the identification of proteins and their chemical modifications from archeological bones. These bones have been attributed to Homo sapiens. The development of a top-down methodology was applied to the analysis of archaeological ceramic. For the first time, a protein (milk casein) was identified in an archaeological sample of an amphora from Claudius emperor era (1st century A.D) via the detection of large fragments of casein. This first application of the top down proteomics showed that new information can be provided such as the in situ molecular degradation.

La spectrométrie de masse est devenue un outil indispensable pour la recherche en protéomique, notamment grâce au développement récent de nouveaux spectromètres de masse comme l’Orbitrap et de nouvelles méthodes de dissociation. La stratégie « bottom-up » (analyse des mélanges de peptides protéolytiques) est la plus utilisée par son efficacement et sa simplicité par rapport à la stratégie top-down (analyse des peptides plus longs ou des protéines intactes), mais cette dernière permet une caractérisation plus complète des isoformes de protéines et des modifications post-traductionnelles.Les méthodes de dissociation utilisant des photons, comme la photodissociation dans le domaine ultra-violet (UVPD) et la dissociation multiphotonique infrarouge (IRMPD), ont reçu une grande attention comme approches alternatives aux méthodes de dissociation par collision. L'absorption du photon UV à haute énergie peut être « diluée » sur l'ensemble du peptide ou de la protéine et provoque une fragmentation étendue du squelette peptidique (liaisons C-C), tandis que les photons IR à faible énergie augmentent progressivement l'énergie interne et dissocient préférentiellement les liaisons amide (C-N) les plus labiles.Cette thèse est centrée sur le développement de méthodes et les applications pour une caractérisation structurale de biomolécules par des méthodes d'activation utilisant des photons. L'intérêt de combiner des photons infrarouges à faible énergie et des photons UV à haute énergie dans un spectromètre de masse Orbitrap, pour la caractérisation de petites protéines, a été évalué. En outre, la dissociation infrarouge multiphotonique a été implémentée dans un piège à ions électrostatique afin d’étendre les méthodes de fragmentation aux macromolécules de très haut poids moléculaires dans le domaine mégadalton. L'une des principales avancées de cette thèse a été d'adapter ces méthodes de spectrométrie de masse aux objets biomoléculaires, allant des petits peptides (dans la gamme de masse de kilodalton) à des fibres de protéines entières (dans la gamme de masse de mégadalton) / The structural characterization of proteins often required them to be fragmented into small units containing only few amino acids. In bottom-up approach, proteins are cleaved into small peptides by enzyme then these peptides are subjected to further fragmentation in a collision cell of a tandem mass spectrometer. However, in top-down approach, proteins can directly be dissociated (without enzyme) into small fragments by collision, electron and photon-driven dissociations. Photon-based activation methods including ultraviolet photodissociation (UVPD) and infrared multiphoton dissociation (IRMPD) have received great attention as an alternative to electron-driven and collision induced dissociation methods. Absorption of the high-energy UV photon is dispersed over the whole peptide or protein and stimulates extensive C?Ca backbone fragmentation while the low-energy IR photons gradually increases the internal energy and thus favorably dissociates the most labile amide (C?N) bonds. This thesis focuses on the method development and applications for characterizing biomolecules by photon-based activation methods. The interest of combining high-energy UV photons and low-energy IR photons in an Orbitrap mass spectrometer, for protein and post-translationally modified peptide characterization, has been evaluated. Moreover, infrared multiphoton dissociation has been implemented in a gated electrostatic ion trap to push forward the limit of fragmentation methods to large megadalton ions. One of the main breakthroughs in this thesis is the ability to adapt these method developments and applications to biomolecular objects ranging from small peptides (in kilodalton mass range) to entire protein fibrils (in megadalton mass range)