Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-11T11:27:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 904628 bytes, checksum: 5d0accfed4bf3ffa5b534f9e166eeacc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T11:27:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 904628 bytes, checksum: 5d0accfed4bf3ffa5b534f9e166eeacc (MD5) Previous issue date: 2001-08-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína BiP (Binding Protein) está envolvida no dobramento correto de proteínas secretórias e retenção no RE de proteínas dobradas ou montadas incorretamente. BiP também atua auxiliando na solubilização de agregados protéicos durante períodos de estresses. Dois clones de BiP de soja, denominados gsBiP6 e gsBiP9, foram isolados a partir das bibliotecas genômicas provenientes dos fagos λEMBL3 e λZAP II, respectivamente. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de elementos G-box. Os promotores de BiP foram fusionados ao gene repórter gus e usados para transformar Nicotiana tabacum via A. tumefaciens. Análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus ou -2200pbip9-gus revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão uniforme de expressão de GUS em folhas, caules e raízes. Intensa atividade histoquímica de GUS foi observada nos feixes vasculares de folhas, caule e raízes e em regiões de traço foliar, assim como, no meristema apical, local onde ocorre intensa divisão celular. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS sugere estar correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Coerente com esta observação, a atividade histoquímica de GUS é muito menos intensa no parênquima xilemático. Deleções do promotor de gsBiP6 foram conduzidas na orientação 5’-3’ (- 138pbip6-gus) e no interior do clone Δ(-226/-82)pbip6-gus. Análise dessas deleções em plantas transformadas, identificaram 2 domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD1 (-358 a -226) e CRD2 (-226 a -82). A região CRD1 exibe atividade de enhancer, já que foi capaz de restaurar altos níveis de expressão basal do gene repórter gus, quando ligada à extremidade 5’ na posição -82 do promotor de BiP6. A região CRD2 contém tanto cis -elementos regulatórios positivos quanto cis -elementos negativos que contribuem para o padrão tecido-específico de expressão controlado pelo promotor de gsBiP6. A expressão do gene repórter na região do procâmbio em raízes, no meristema apical e no floema de caule foi absolutamente dependente da região CRD2. Em contraste, deleção de CRD2 resultou em acúmulo acentuado de atividade de GUS no parênquima xilemático. A ativação dos promotores BiP6 e BiP9 em resposta ao acúmulo de proteínas anormais no retículo endoplasmático (UPR) e em respostas a estresse osmótico foi avaliada em discos foliares transgênicos. Tratamento dos discos foliares com tunicamicina, ativador da via UPR, e com PEG, indutor de um estresse osmótico, induziu a expressão de GUS, sob o controle do pro motor BiP6 e do promotor BiP9. A deleção da região CRD2 (-226 a -82) no promotor BiP6 causou a perda da inducibilidade da expressão gênica em resposta a tunicamicina e PEG, indicando que CRD2 contém elementos cis-atuantes de resposta a estresse. De fato, dois cis-elementos conservados atuantes na via UPR (UPRE) foram identificados na região CRD2. Coletivamente, estes resultados sugerem que o controle da expressão de BiP em plantas depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor. / The binding protein BiP is involved in the correct folding of secretory proteins and retention in the RE of unfolded proteins. BiP also prevents nonproductive intermolecular interactions of folding intermediates and subsequent misaggregation of proteins during stress conditions. We have isolated two genomic clones named gsBiP6 and gsBiP9 from λEMBL3 and λZAP II genomic libraries, respectively. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters have general motifs founded in plant gene promoters, such as CAAT and TATA sequence, and specific motifs, such as endoplasmatic reticulum stress response element (ERSE) and G-box elements. The BiP promoters were fused to the reporter gene β-glucuronidase (GUS) and introduced into tobacco plants via Agrobacterium tumefaciens transformation. Histochemical analysis of transformed plants with the constructions -358pbip6-gus or -2200pbip9-gus revealed that the BiP promoters produced a uniform pattern of the GUS expression in leaves, stems, and roots. Intense GUS histochemical activity was observed in the vascular region of leaves,stems and roots, and in the leaf trace region as well as in the apical meristem, place where intense cellular division happens. This pattern of space distribution of the GUS activity suggests to be correlated with an expression of those genes in places that have high cellular secretory activity and high proportion of cells in an active process of cellular division. Coherent with this observation, the histochemical activity of GUS is much less intense in the xylem parenchyma. The gsBiP6 promoter deletions were driven in the 5'-3' orientation (-138pbip6-gus) and intern region Δ(-226/- 82)pbip6-gus. Analysis of those deletions in transformed plants identified two regulatory domains cis-acting, denominated CRD1 (-358 to -226) and CRD2 (- 226 to -82). The CRD1 exhibits enhancer activity, since it was capable to recuperate high levels of basal expression of the gus reporte r gene when linked to the extremity 5' in the position -82 of the BiP6 promoter. The CRD2 contains positive regulatory cis -elements, as negative regulatory cis -elements that contribute to the specific pattern of expression controlled by the gsBiP6 promoter. The reporter gene expression in the root procambium region, in the apical meristem and in the phloem stem, was absolutely dependent on the CRD2. In contrast, CRD2 deleted resulted in accentuated accumulation of GUS activity in the xylem parenchyma. The activation of the BiP6 and BiP9 promoters, in response to the unfolded proteins response in the endoplasmatic reticulum (UPR) and osmotic stress condition, were evaluated in transgenic leaf disks. Leaf disks incubated with tunicamycin, activator of the UPR, and with PEG, inductor of an osmotic stress, induced the expression of GUS, under the BiP6 and BiP9 promoters control. The CRD2 (-226 to -82) deleted in the BiP6 promoter caused the loss of the induction of the expression in response to tunicamycin and PEG, indicating that CRD2 contains responsive cis-acting elements under stress conditions. In fact, two conserved cis-acting elements in the UPR (UPRE) were identified in the CRD2. Collectively, these results suggest that the control of the expression of BiP in plants depends on a complex integration of multiple regulatory cis-elements in the promoter.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-29T16:38:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 671657 bytes, checksum: f28658698bf95e26a5cf8beb3fc64078 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T16:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 671657 bytes, checksum: f28658698bf95e26a5cf8beb3fc64078 (MD5) Previous issue date: 1997-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A proteína BiP, residente no lúmen do retículo endoplasmático (RE), tem sido descrita como um componente importante no processo de dobramento e montagem de proteínas secretórias recém-sintetizadas. Com base na localização subcelular, identidade imunológica, massa molecular relativa e síntese constitutiva, foi possível identificar o homólogo de BiP da soja, usando-se anticorpos preparados contra BiP do milho. A análise do padrão de acúmulo da proteína BiP revelou que a sua síntese é coordenada, temporalmente, com a síntese de proteínas de reserva na semente. Além disso, a síntese de BiP é correlacionada com a concentração de proteína total acumulada na semente de diferentes variedades de soja. Esses resultados indicam que a proteína BiP é induzida pelo aumento da atividade secretória do cotilédone, associada à síntese ativa de proteínas de reserva. Consistente com sua função de chaperone molecular, BiP é induzida em resposta a diversos estresses fisiológicos que promovem a proliferação do RE e o acúmulo de proteínas mal dobradas nesta organela. Infestação por Tetranichus urticae e infecção por Cercospora sojina Hara induziram a síntese de BiP em níveis comparáveis. Similarmente, sua síntese foi induzida, significativamente, em resposta a estresse nutricional. Ao contrário de BiP de espinafre, BiP de soja é regulada positivamente por estresse hídrico. Esses resultados contraditórios indicam que vias distintas de mecanismos regulatórios controlam a expressão dos genes BiP em plantas. Como membro da família Hsp70, foi demonstrado que a proteína BiP da soja se liga a ATP e associa-se com polipeptídios sintetizados exclusivamente na semente. No entanto, o complexo formado entre BiP e esses polipeptídios é altamente estável e insensível a ATP. A propriedade de BiP de se ligar a ATP foi explorada como meio de purificar essa proteína a partir de extratos protéicos de sementes, usando-se cromatografia de afinidade em resinas de ATP-agarose. Conforme julgado através de géis de acrilamida corados com prata, BiP foi purificada em um nível de homogeneidade em torno de 90%. A identidade da proteína purificada foi confirmada, uma vez que seus anticorpos reconheceram eficientemente a proteína expressa pelo clone cUFVBiP1, que codifica BiP da soja. / The protein BiP, reticulum endoplasmic resident molecular chaperone, has been described as an important mediator of folding and assembly of newly- synthesized proteins. Based on the subcelular localization, immunological identity, relative molecular mass and constitutive synthesis, we have identified the BiP homologue from soybean, using a maize BiP antibody. The pattern of BiP accumulation reveals that its synthesis is temporally coordinated with the seed storage protein synthesis. In addition, the BiP synthesis is correlated with the concentration of total protein in seeds of different soybean varieties. These results suggest that BiP is induced in response to the secretory activity of the cotyledon, which is associated with the active synthesis of storage proteins. As a molecular chaperone, we have found that soybean BiP is induced in response to several physiological stresses which promote the proliferation of the ER and an accumulation of unfolded proteins within the lumen of this organelle. Tetranichus urticae attack and Cercospora sojina infection induced the BiP synthesis to the same extend. Likewise, its synthesis was induced, considerably, in response to nutritional stress. Unlike spinach BiP, soybean BiP is upregulated by water stress. These controversial results suggest that disctint pathways of regulatory mechanisms control the BiP gene expression in plants. As a member of the Hsp70, we have demonstrated that soybean BiP binds to ATP and associates with seed polypeptides. However, these complexes are highly stable and insensitive to ATP. We have taken advantage of the BiP ATP-binding activity as a mean to purify this protein from whole seed protein extracts through affinity chromatography. As judged by silver-staining electrophoresis acrylamide gels, BiP was purified to 90% homogeneity. The identity of the purified protein was further confirmed, since antibodies prepared against it recognize efficiently a recombinant protein expressed by a soybean cDNA.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-01T12:08:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 631605 bytes, checksum: 52432c66349cbd1015ae06e8db596889 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T12:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 631605 bytes, checksum: 52432c66349cbd1015ae06e8db596889 (MD5) Previous issue date: 1998-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Proteínas solúveis e de membrana da rota secretora são inicialmente endereçadas ao retículo endoplasmático (RE) e translocadas através da membrana deste. Em seguida, elas transitam através do Golgi para alcançar os compartimentos subcelulares e o meio extracelular. O RE mantém uma eficiente maquinaria de translocação, dobramento, associação, montagem de oligômeros e controle de qualidade de proteínas secretórias. A proteína BiP ("Binding Protein"), residente no RE, exibe atividade de chaperone molecular e participa ativamente neste processo por meio de interações proteína:proteína. Com o objetivo de identificar substratos potenciais de BiP, anticorpos contra frações microssomais isoladas da semente de soja foram usados para o escrutínio de uma biblioteca de expressão. Um clone de cDNA, denominado pUFVS64, que codifica uma proteína secretória, foi isolado e caracterizado. A proteína, codificada por pUFVS64 e denominada S-64, é sintetizada na semente de soja, em baixos níveis, e possui uma identidade de seqüência de 85% com uma proteína de membrana que se liga à sacarose, denominada SBP ("Sucrose Binding Protein"). Células intactas foram utilizadas para introdução de genes via eletroporação, ou biobalística, com o objetivo de aumentar a síntese da proteína S-64 em suspensões celulares de soja, de forma a aumentar a sensibilidade dos ensaios para determinação de associações entre as proteínas BiP e S-64.A associação entre BiP e S-64 foi avaliada, levando-se em consideração características bioquímicas diferenciadas, associadas com as referidas proteínas. Ensaios de sedimentação por afinidade, com o uso das resinas de ATP-agarose, GTP-agarose e ConA- sepharose, foram conduzidos, utilizando-se extratos de proteína total, de suspensões celulares de soja. Tanto S-64 quanto BiP são co-precipitadas por GTP-agarose, embora BiP não se associe com este nucleotídeo. A capacidade da resina GTP-agarose em sedimentar BiP reflete associação prévia entre BiP e uma proteína que liga GTP. Similarmente, ATP-agarose foi eficiente em co-sedimentar ambas as proteínas, embora apenas BiP se ligue diretamente à ATP. A sedimentação indireta de S-64 pela resina ATP-agarose demonstrou que S-64 estava a uma proteína que liga a ATP. A proteína S-64 é glicosilada e se liga diretamente a ConA-sepharose, enquanto BiP não se associa diretamente com concanavalina-A. Mesmo assim, BiP foi co-sedimentada indiretamente por ConA- sepharose. Coletivamente, estes resultados sugerem que S-64 interage com BiP, constituindo um substrato em potencial para caracterização de associações mediadas pela proteína BiP de plantas. / Newly synthesized secretory and membrane proteins are synthesized on membrane-bound polysomes and co-translationally sequestered in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). These proteins then move to and through the Golgi complex where they are either secreted or sorted to subcelullar compartments. The ER keeps an efficient machinery for translocation, association, assembly of secretory proteins which functions as a quality control system of protein exit from this organelle. The ER-resident protein BiP (Binding Protein) exhibits a molecular chaperone activity and has been described as an important component of the quality control mechanism in the ER which is mediated by protein:protein interaction. In order to identify potential substrates for BiP, antibodies raised against membrane-enriched protein fractions from soybean seeds where used as a probe to screen a expression library. A cDNA clone, named pUFVS64, that encodes a secretory protein was isolated and characterized. The cDNA-encoded protein, designated S-64, is synthesized at low levels in soybean seeds and shares 85% sequence identity with the sucrose binding protein (SBP) which is a membrane-associated protein. In order to increase the sensitivity in the assays for detection of BiP:S-64 associations, the S- 64 cDNA was introduzed in soybean cultured cells by electroporation or a biolistic particle delivery system. The S-64:BiP association was evaluated taking advantage of the differential biochemical properties associated with the proteins. Affinity-precipitation assays, using ATP-agarose, GTP-agarose and ConA- sepharose resins, were performed with total protein extracts from soybean cultured cells. Both S-64 and BiP are co-precipitated by GTP-agarose, although BiP does not bind to GTP. The capacity of GTP-agarose to precipitate BiP reflects previous association between BiP and a GTP-binding protein. Likewise, the ATP-agarose resin co-precipitates efficiently both proteins, although just BiP binds ATP. The indirect precipitation of S-64 by ATP-agarose demonstrated that S-64 interacts with an ATP-binding protein. The S-64 protein is glycosylated and binds directly to ConA-sepharose, while BiP does not. However, the efficiency of BiP precipitation by ConA-sepharose was as high as of S-64 precipitation. Taken together, these results suggest that S-64 interacts with BiP and may be a potential substrate for the characterization of protein interactions mediated by plant BiP. / Não foi localizado o cpf do autor.