In the past two decades, the identification of the structures involved in the mechanisms of cancer development have led to a paradigm shift in cancer therapy. Since 2001 orally administered small molecules such as kinase inhibitors are fundamental drugs in the personalized and targeted therapy of hematologic and oncologic neoplasms. However, side effects, therapeutic success is often accompanied by relevant restrictions, which may result in disease progression, a low quality of life, or treatment discontinuation. In addition, for some kinase inhibitors, therapy failure during treatment after an initially good response has been reported. It is known that the response to drug therapy varies considerably in patients. The same dosage may be effective in some patients while ineffective or toxic in others. Interindividual variabilities in drug exposure, and consequently sub- or supratherapeutic serum concentrations may be the cause. Factors such as drug-drug- or food-drug-interactions with drug-metabolizing enzymes and lifestyle (e.g., smoking, weight) are known to cause interindividual differences. In general, oral administration is predetermined to cause large interindividual variability in drug exposure because absorption in the gastrointestinal tract depends on food intake and the intragastric pH. For the recently approved kinase inhibitors afatinib, axitinib, bosutinib, cabozantinib, dabrafenib, lenvatinib, nilotinib, osimertinib, ruxolitinib, and trametinib, interindividual variability despite the same dosage has been described. So far, knowledge on the serum exposure and the therapeutically relevant serum concentrations from clinical routine is scarce. It is unclear whether side effects correlate with achieved serum concentrations and if therapy failure correlates with subtherapeutic serum concentrations. Innovation and paradigm shift are not only observed in cancer therapy but also in the handling of complications following cancer therapy. In patients undergoing allogeneic stem cell transplantation (allo-HSCT), cytomegalovirus (CMV) reactivation and disease are associated with increased transplant related mortality. Letermovir is a novel anti-CMV drug, which is used for prophylaxis in adult CMV-seropositive allo-HSCT recipients. Letermovir represents a scientific breakthrough, as the side effect profile compares favorably with the known highly toxic anti-CMV agents. However, letermovir is the victim and perpetrator in many clinically relevant drug-drug-interactions. As known from other anti-viral agents, inter- or intraindividual variability in systemic exposure may lead to therapy failure or the development of drug resistance. In vitro and clinical observations suggest that letermovir has a low genetic barrier to resistance. So far, knowledge on the serum exposure and the therapeutically relevant serum concentrations of letermovir from clinical routine is scarce. The objective of this work was to develop bioanalytical methods which are then used for the quantification of the systemic exposure of the ten kinase inhibitors and the anti-CMV agent letermovir in clinical routine. The aim was to gain first insights into the achieved serum concentration and the extent of interindividual variability in treated patient in a real-life setting. First, a high-performance-liquid chromatography (HPLC) method coupled with tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantification of the ten kinase inhibitors was developed and validated according to the relevant U.S. Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA) guidelines. Expected cabozantinib, dabrafenib, nilotinib and osimertinib serum concentrations were quantifiable using the less sensitive but widely available diode array detector (DAD). Therefore, a cost-efficient alternative using HPLC coupled with DAD was developed and validated accordingly. The HPLC-DAD method was cross-validated using the gold standard LC-MS/MS and patient samples. For all four kinase inhibitors over 67% of patient samples per compound met FDA and EMA limits for reanalysis and EMA limits for cross-validation. The results indicate that the measured concentrations are comparable when using two different detectors. The developed LC-MS/MS method was applied to measure patient serum samples. Patients receiving the commonly used kinase inhibitors cabozantinib, dabrafenib, nilotinib, osimertinib, ruxolitinib and trametinib showed a high interindividual variability in serum concentrations for the same kinase inhibitor at the same dosage. The number of patients receiving afatinib (one) and osimertinib (two) was not sufficient to draw definite conclusions. Within this work, more detailed investigations were conducted in melanoma patients treated with dabrafenib and trametinib and in patients who received ruxolitinib after allo-HSCT for the treatment of Graft-versus-Host-Disease (GvHD). In melanoma patients, the median of the individual mean trough levels was 45.0 ng/mL (range: 20-155 ng/mL, dosage: 150 mg twice daily). For trametinib, the median of the mean trough levels was 11.2 ng/mL (range: 6.22-15.9 ng/mL, dosage: 2 mg once daily). Dose adjustments because of undesirable side effects in clinical routine were common. The observed data do not support a general monitoring of dabrafenib and trametinib in clinical routine. However, they provide the evidence for associations between toxicity and exposure, supporting the existing literature. Therefore, measuring exposure may assist decision-making regarding dose adjustments in clinical routine. In GvHD patients, a high degree of inter individual variability in median serum trough levels was observed: 39.9 ng/mL (range: 5.6-99.8 ng/mL, dosage: 10 mg twice daily). Patients not requiring dose reduction due to side effects had a significantly higher median of individual mean trough serum concentrations at the same daily dose (39.8 ng/mL versus 60.6 ng/ml). The study showed that a serum concentration of 21.1 ng/mL before next dose intake was associated with experiencing at least three side effects which should be evaluated in future studies. The study in GvHD patients showed that ruxolitinib, a predominantly Cytochrome P450 (CYP) 3A4 substrate, is commonly co-administered with posaconazole, a CYP3A4 inhibitor. Depending on the regulatory agency, the recommendations regarding dose adjustment were different (no (FDA) vs. 50% (EMA) dose adjustment). The magnitude of drug-drug-interaction in our clinical situation was investigated by developing a physiologically-based pharmacokinetic model using PK-Sim. The model predicted an increase in ruxolitinib maximum plasma concentration and area under the concentration-time curve by 20.5% and 59%, respectively, due to the concomitant posaconazole administration. The observed data do not support a general dose reduction by 50%, as suggested by the EMA. However, given the observed high degree of variability in ruxolitinib exposure some patients may be at risk for ruxolitinib overexposure because of the described interaction. Therefore, standard dosing should be applied with caution and ruxolitinib exposure should be monitored to identify patients at risk for overexposure and associated toxicity. For the quantification of letermovir serum concentrations a HPLC-DAD method was developed, validated, and applied to patient samples. A high degree of interindividual variability was observed. The analysis of trough concentrations revealed a median letermovir concentration of 2,603 ng/mL ( range: 175–12,281 ng/mL). The data represent first findings on letermovir exposure in routine clinical practice and remain to be placed in a clinical context. The developed methods and the results of this work provide the basis for future clinical investigations regarding dose individualization for the investigated kinase inhibitors and letermovir. Given the observed variability between patients at the same dosage, the methods are helpful to identify patients at risk for over- or underdosing at an early stage during therapy. Measuring drug exposure and establishing safe and effective therapeutic ranges may assist decision-making regarding dose adjustments in clinical routine. / In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Identifizierung von Strukturen, die an den Mechanismen der Krebsentstehung beteiligt sind, zu einem Paradigmenwechsel in der Krebstherapie geführt. Seit 2001 sind oral verabreichte „small molecules“ wie Kinase-Inhibitoren grundlegende Bestandteile der personalisierten und gezielten Therapie von hämatologischen und onkologischen Neoplasien. Aufgrund ihrer Nebenwirkungen ist der therapeutische Erfolg jedoch oft mit erheblichen Einschränkungen verbunden, die unter anderem zum Fortschreiten der Krankheit, zu einer geringen Lebensqualität oder zum Abbruch der Behandlung führen können. Darüber hinaus wird bei einigen Kinase-Inhibitoren über Therapieversagen während der Behandlung nach anfänglich gutem Ansprechen berichtet. Es ist bekannt, dass das Ansprechen auf eine Arzneimitteltherapie bei Patienten sehr unterschiedlich ausfällt. Die gleiche Dosierung kann bei einigen Patienten wirksam, bei anderen dagegen unwirksam oder toxisch sein. Interindividuelle Schwankungen in der Serum- oder Plasmakonzentration und folglich sub- oder supratherapeutischen Serumkonzentrationen können die Ursache sein. Faktoren wie Interaktionen zwischen Enzymen des Metabolismus und Arzneimitteln oder Nahrungsmitteln, und der Lebensstil (beispielsweise Raucherstatus und Gewicht) können zu interindividuellen Unterschieden in der Arzneimittelexposition führen. Im Allgemeinen ist bei oraler Verabreichung eine große interindividuelle Variabilität der Arzneimittelexposition zu erwarten, da die Absorption im Gastrointestinaltrakt von der Nahrungsaufnahme und dem pH-Wert im Magen abhängt. Für die kürzlich zugelassenen Kinase-Inhibitoren Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Dabrafenib, Lenvatinib, Nilotinib, Osimertinib, Ruxolitinib und Trametinib wurde eine Variabilität der Serumspiegel zwischen Patienten bei gleicher Dosierung beschrieben. Bislang gibt es nur wenige Erkenntnisse über die Serumexposition und die therapeutisch relevanten Serumkonzentrationen aus der klinischen Routine. Es ist unklar, ob Nebenwirkungen mit den erreichten Serumkonzentrationen korrelieren, und ob ein Therapieversagen mit subtherapeutischen Serumkonzentrationen zusammenhängt. Innovation und Paradigmenwechsel sind nicht nur in der Krebstherapie zu beobachten, sondern auch bei der Behandlung von Komplikationen nach einer Krebstherapie. Bei Patienten, die sich einer allogenen Stammzelltransplantation (allo-HSCT) unterziehen, sind die Reaktivierung des Cytomegalievirus (CMV) und die Erkrankung mit einer erhöhten transplantationsbedingten Sterblichkeit verbunden. Letermovir ist ein neues Anti-CMV-Medikament, das zur Prophylaxe bei erwachsenen CMV-seropositiven allo-HSCT-Empfängern eingesetzt wird. Letermovir stellt einen wissenschaftlichen Durchbruch dar, da das Nebenwirkungsprofil im Vergleich zu den bekannten hochtoxischen Anti-CMV-Wirkstoffen günstig ist. Letermovir ist jedoch Opfer und Verursacher vieler klinisch relevanten Arzneimittelwechselwirkungen. Wie von anderen antiviralen Arzneimitteln bekannt, können inter- oder intraindividuelle Schwankungen der systemischen Exposition zu Therapieversagen oder der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen führen. In-vitro- und klinische Beobachtungen deuten darauf hin, dass Letermovir eine niedrige genetische Barriere für Resistenzen aufweist. Bislang gibt es jedoch nur wenige Daten zur Serumexposition und die therapeutisch relevanten Serumkonzentrationen von Letermovir aus der klinischen Routine. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bioanalytische Methoden entwickelt, die dann zur Quantifizierung der systemischen Exposition der zehn genannten Kinase-Inhibitoren und des Anti-CMV-Wirkstoffes Letermovir in der klinischen Routine eingesetzt wurden. Ziel war es, erste Erkenntnisse über die erreichten Serumkonzentrationen und das Ausmaß der interindividuellen Variabilität bei behandelten Patienten in einer realen Umgebung zu gewinnen. Zunächst wurde eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Methode (HPLC) gekoppelt mit einem Tandem-Massenspektrometer (LC-MS/MS) zur Quantifizierung der zehn Kinase-Inhibitoren entwickelt und gemäß den einschlägigen Richtlinien der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittelagentur (EMA) validiert. Die erwarteten Cabozantinib-, Dabrafenib-, Nilotinib- und Osimertinib-Serumkonzentrationen waren mit dem weniger empfindlichen, aber weit verbreiteten Diodenarray-Detektor (DAD) quantifizierbar. Daher wurde eine kosteneffiziente, alternative Methode unter Verwendung von HPLC gekoppelt mit DAD entwickelt und entsprechend validiert. Die HPLC-DAD-Methode wurde mit dem Goldstandard LC-MS/MS und Patientenproben kreuzvalidiert. Bei allen vier Kinase-Inhibitoren erfüllten pro Substanz mehr als 67 % der Patientenproben die FDA- und EMA-Grenzwerte für die Reanalyse und die EMA-Grenzwerte für die Kreuzvalidierung. Die Ergebnisse zeigen, dass die gemessenen Konzentrationen mithilfe der unterschiedlichen Detektoren vergleichbar sind. Mit der LC-MS/MS-Methode wurden Serumproben von Patienten gemessen. Patienten, die mit den häufig verwendeten Kinase-Inhibitoren Cabozantinib, Dabrafenib, Nilotinib, Osimertinib, Ruxolitinib und Trametinib behandelt wurden, zeigten bei gleicher Dosierung eine hohe interindividuelle Variabilität der Serumkonzentrationen. Die Anzahl der Patienten, die Afatinib (einer) und Osimertinib (zwei) erhielten, reichte nicht aus, um eindeutige Schlussfolgerungen zu ziehen. Im Rahmen der Arbeit wurden detailliertere Untersuchungen bei Patienten mit Melanom, die mit Dabrafenib und Trametinib behandelt wurden, sowie bei Patienten, die Ruxolitinib nach einer allo-HSCT im Rahmen Behandlung der Graft-versus-Host-Disease (GvHD) erhielten, durchgeführt. Bei Melanompatienten lag der Median der individuellen mittleren Talspiegel für Dabrafenib bei 45,0 ng/mL (Spannweite: 20-155 ng/mL, Dosierung: 150 mg zweimal täglich). Für Trametinib lag der Median der mittleren Talspiegel bei 11,2 ng/mL (Spannweite: 6,22-15,9 ng/mL, Dosierung: 2 mg einmal täglich). Dosisanpassungen aufgrund von unerwünschten Nebenwirkungen in der klinischen Routine waren häufig. Die beobachteten Daten sprechen nicht für eine generelle Überwachung der Dabrafenib- und Trametinib-Spiegel in der klinischen Routine. Sie weisen jedoch darauf hin, dass es zwischen Toxizität und Exposition einen Zusammenhang gibt, und stützen damit die bestehende Literatur. Daher kann die Messung der Exposition bei Entscheidungen in Bezug auf die Dosisanpassung hilfreich sein. Bei GvHD-Patienten wurde ein hohes Maß an interindividueller Variabilität der mittleren Serum-Talspiegel beobachtet: 39,9 ng/mL (Spannweite: 5,6-99,8 ng/mL, Dosierung: zweimal täglich 10 mg). Bei Patienten, die keine Dosisreduzierung aufgrund von Nebenwirkungen benötigten, war der Median der individuellen mittleren Serum-Talspiegel bei gleicher Tagesdosis signifikant höher (39,8 ng/mL versus 60,6 ng/mL). Eine Serumkonzentration von 21,1 ng/mL vor der nächsten Dosiseinnahme konnte mit dem Auftreten von mindestens drei Nebenwirkungen jeglichen Grades assoziiert werden. Dieser Wert sollte in zukünftigen Studien evaluiert werden. Die Studie an GvHD-Patienten zeigte, dass Ruxolitinib, ein vorwiegend über Cytochrome P450 (CYP) 3A4 verstoffwechseltes Substrat, häufig zusammen mit Posaconazol, einem CYP3A4-Inhibitor, verabreicht wird. Je nach Zulassungsbehörde waren die Empfehlungen zur Dosisanpassung unterschiedlich (keine laut FDA bzw. 50 % Dosisanpassung laut EMA). Das Ausmaß der Arzneimittelwechselwirkung, in der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten klinischen Studie, wurde durch die Entwicklung eines physiologisch basierten pharmakokinetischen Modells mit PK-Sim untersucht. Mithilfe des Modells wurde ein Anstieg der maximalen Plasmakonzentration von Ruxolitinib und der Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve um 20,5 % bzw. 59 % aufgrund der gleichzeitigen Verabreichung von Posaconazol vorausgesagt. Die Daten sprechen nicht für eine allgemeine Dosisreduktion um 50 %, wie von der EMA vorgeschlagen. Angesichts der beobachteten großen Variabilität der Ruxolitinib-Exposition besteht jedoch bei einigen Patienten, aufgrund der beschriebenen Wechselwirkung, möglicherweise ein Risiko für eine Ruxolitinib-Überdosierung. Daher sollte die Standarddosierung mit Vorsicht angewendet und die Ruxolitinib-Exposition überwacht werden, um Patienten zu identifizieren, bei denen ein Risiko für eine Überexposition und eine damit verbundene Toxizität besteht. Zur Quantifizierung der Letermovir-Serumkonzentrationen wurde eine HPLC-DAD-Methode entwickelt, entsprechend den Richtlinien der EMA und FDA validiert und auf Patientenproben angewendet. Es wurde ein hohes Maß an interindividueller Variabilität beobachtet. Die Analyse des Talspiegel ergab eine mediane Letermovir-Konzentration von 2.603 ng/mL (Spannweite: 175-12.281 ng/mL). Die Daten stellen erste Erkenntnisse zur Letermovir-Exposition in der klinischen Routine dar und bleiben in den klinischen Kontext einzuordnen. Die entwickelten Methoden und die Ergebnisse dieser Arbeit bilden die Grundlage für zukünftige klinische Untersuchungen zur Dosisindividualisierung für die untersuchten Kinase-Inhibitoren und Letermovir. Angesichts der beobachteten Variabilität zwischen den Patienten bei gleicher Dosierung, sind die hier beschriebenen Methoden hilfreich, um Patienten mit dem Risiko für eine Über- oder Unterdosierung frühzeitig zu erkennen. Die Messung der Serumkonzentration und die Festlegung sicherer und wirksamer therapeutischer Bereiche können die Entscheidungsfindung in Bezug auf die Dosisanpassung in der klinischen Routine unterstützen.

Techn. Hochsch., Diss., 2002--Aachen.

Universiẗat, Diss., 2002--Dortmund.

Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main).

Als die häufigste tödliche Tumorerkrankung weltweit ist das Lungenkarzinom mit einer sehr schlechten Prognose verbunden. Eine Behandlungsoption für Lungenadenokarzinome, die eine aktivierende EGFR-Mutation aufweisen, ist der orale EGFR-TKI Gefitinib (Iressa®, ZD1839). Die Resistenzentwicklung von Tumoren gegen diese Therapie stellt ein großes klinisches Problem dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Dosis-Wirkungs-Beziehung von Gefitinib, sowie die Entwicklung von Resistenzen in einem etablierten humanen 3D Lungentumormodell zu untersuchen und dieses Testsystem für eben diese Fragestellungen zu validieren. Vorliegende Arbeit bestätigt, dass pharmakologische Untersuchungen in Zellkulturen häufig zu einer Überschätzung des Behandlungserfolges führen. Das verwendete Modell entspricht mehr den in vivo Bedingungen. In dieser Arbeit wurden zwei ATP-Zellvitalitätsassays für die statischen 3D Lungentumormodelle etabliert und erfolgreich angewendet. Dabei zeigte sich eine konzentrationsabhängige Wirkung von Gefitinib auf das Wachstum, die Proliferation, die Apoptose, die Markerexpression sowie die Signalwegsaktivierungen. Im statischen 3D Lungentumormodell lag der IC50-Wert zwischen 0,05-0,1 µM Gefitinib welches den Werten aus klinischen Beobachtungen entspricht. Auch der in der Klinik bereits nach wenigen Stunden eintretende zeitliche Effekt von Gefitinib konnte in unserem Modell bestätigt werden. Eine dynamische Kultivierung der Lungentumorzellen, mit von Scherkräften verursachtem schnellerem Zellwachstum, führte zu einer weiteren Annährung an die klinischen Gegebenheiten. Das Netzwerk der Gefitinib-Wirkung auf die EGFR-Signalkaskade wurde in unserem Modell charakterisiert. Die Betrachtung einer resistenten Zell-Subpopulation zeigte einen Resistenzmechanismus über eine Epitheliale-Mesenchymale-Transition. Zusätzlich wurde versucht, eine neue medikamenten-resistente Zell-Subpopulation zu generieren. Das beschriebene 3D Lungentumormodell ermöglicht richtungsweisende Untersuchungen zu Dosis-Wirkungs-Beziehung von Gefitinib. Ansätze für eine weitere Optimierung des Modells wurden herausgearbeitet. / Lung cancer is the deadliest proliferative disease worldwide and associated with a poor prognosis. One option for treatment of adenocarcinomas of the lung with an activating epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation is the oral EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) Gefitinib (Iressa®, ZD1839). The development of resistances against EGFR-TKIs is a predominant clinical threat. The aim of this dissertation was to further explore the relations of dose and impact of Gefitinib and the development of resistances in an established three dimensional (3D) human lung cancer model. The models accuracy was analysed. This study confirmed that pharmacological testing in cell cultures often leads to an overestimation of the treatment while our model represents in vivo conditions in a more accurate way. Initially two ATP-cell viability assays were established and successfully used in the static 3D lung cancer model. Gefitinib had a concentration-dependent impact on cell growth, proliferation, apoptosis, the expression of markers and the activation of signalling pathways. In the static 3D lung cancer model the half maximal inhibitory concentration was reached between 0.05 µM and 0.1 µM Gefitinib. The effect of Gefitinib was apparent after several hours. These findings confirmed clinical observations. To mimic the clinical setting further the lung cancer cells were cultivated under dynamic conditions which lead to shear forces and a resulting rise in cell growth. In our model we characterized the network of the EGFR signalling pathways. Exploration of a resistant subpopulation of adenocarcinoma cells revealed an epithelial-mesenchymal transition of the cells. The generation of another resistant subpopulation was attempted. The described 3D lung cancer model can be used for an indicatory analysis of Gefitinib and its properties. Options for further improvement were explored.

Techn. University, Diss., 2005--München.