Techn. University, Diss., 2004--Berlin.

Techn. Hochsch., Diss., 2005--Aachen.

Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist und eine Schlüsselrolle in der Protein-Homöostase spielt. Die funktionale Diversität von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Domäne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein könnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Domäne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor wäre nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern hätte auch einen besonderen Nutzen für die Entschlüsselung molekularer und zellulärer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz für die Identifizierung von chemischen Startstrukturen für die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Domäne gewählt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergestützte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, Röntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Darüber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgeführten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen für die experimentelle Validierung ausgewählt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden bestätigt werden. In einem parallel durchgeführten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Domäne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay bestätigt. Fünf dieser Verbindungen zeigten Affinitäten mit KD-Werten kleiner 500μMund günstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinität des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Domäne bestätigt werden. Zur Identifizierung möglicher Bindestellen dieser fünf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Domäne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit mögliche Ankerpunkte für die Weiterentwicklung dar. Für zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels Röntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten bestätigt werden. Die erhaltene Röntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Domäne zeigt. / The AAA+ATPase p97 is an essential protein involved in numerous cellular pro-cesses and plays a key role in multiple aspects of protein homeostasis. Its functio-nal diversity is mediated through the interaction with a large number of distinctcofactors binding to the N-domain of p97. Due to its significant role in regulatinga variety of physiological responses, p97 has emerged as a potential therapeu-tic target. A small molecule inhibiting the cofactor binding would be importantto dissect the molecular and cellular functions of p97 cofactors, thus helping tounravel their specific role in controlling p97 activity. Such compounds may alsoopen routes to new cancer therapies.In this work, a fragment-based approach was pursued for the identification ofchemical starting points for the development of a protein-protein interaction in-hibitor addressing the SHP binding site. Therefore, computer-assisted methods,such as virtual screenings and molecular dynamics simulations, as well as bio-physical techniques including biolayer interferometry, X-ray crystallography, andligand-based NMR techniques, were applied.The computer-based design started with an analysis of the known p97 crystalstructures in complex with the SHP motifs of cofactors UFD1 and Derlin-1. In ad-dition, molecular dynamics simulations were used to analyze the water proper-ties within the SHP binding site. Based on these results, pharmacophore modelswere developed and utilized in the subsequent virtual screening and dockingprocess. With the help of molecular dynamics simulations, ten compounds wereselected for experimental validation. Two of these were confirmed as ligands inSTD-NMR and biolayer interferometry experiments.In parallel, a biophysical fragment screening of over 650 compounds was perfor-med using the biolayer interferometry method. This led to the identification of22 compounds binding to the N-domain. Fifteen of these fragments were con-firmed in an orthogonal STD-NMR assay. Five compounds showed affinities withKDvalues below 500 μM and favourable ligand efficiencies for further optimiza-tion. Furthermore, the binding kinetics and affinity of xanthohumol, a naturalproduct reported in the literature as a p97 inhibitor, were determined and bin-ding to the N-domain was confirmed. xToidentify possible binding sites of these five fragments, mixed solvent mole-cular dynamics simulations were performed. These revealed that all compoundsaddress the SHP binding site in the N-domain. The regions coincide with hotspots of the cofactor binding and, thus, represent potential anchor points for aprotein-protein interaction inhibitor. For two fragments, the postulated bindingsites were confirmed by X-ray crystallography and STD-NMR measurements onp97 alanine mutants, respectively. The X-ray structure obtained is the first p97structure showing a fragment bound to the N-domain.

Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht. Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten. Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs 104 mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen. Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben. Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen. / Proteins are composed of a specific sequence of variable amino acids that specify their specific function. The vast variability of possible amino acid sequences allowed for the evolution of a nearly infinite number of different proteins. Mostly these will have key positions, reaching from strong building material to molecular machines. Therefore a malfunction will have an immense effect on life, i.e. diseases like Alzheimer disease or epilepsy. In order to understand the function and malfunction an intense understanding of the protein folding, the protein-protein association, as well as the protein dynamics is essential. These processes have been investigated in this thesis with three isolated protein domains by the application of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer-formation and by the photoinduced electron transfer. The unfolded state of the binding domain BBL, which is part of the 2-oxo-acid-dehydrogenase-complex, was analysed under physiological conditions by circular dichroism (CD), and a combination of photoinduced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Both methods showed accordingly, using 20 singly implanted conservative point mutations in BBL, that side-chain interactions have no effect on the secondary struc-ture of the denatured condition, the initial state of the folding. Using deconvolution on the CD spectra it was shown in addition, that the remaining structure of the helical protein domain in the denatured state is dominated by β-strands and β-turns. These may have a decisive function during the folding in the native state. The N-terminal domain of the spider silk fibre, which is of high interest for the material research, is responsible for the polymerisation of the spider silk fibre during the pH-change from pH 7 to pH 6. This important process for the protein function was investigated with the Stopped-Flow technique by the application of an extrinsic fluorescence switch, based on the H-dimer formation. It was shown, that NTDs associate with a rate of 3 x 10^8 M-1 s-1, and so nearly reach the speed limit of the protein-protein association. In this process two charged side chains, the D39 and D40, have a decisive function, as a mutation of these will 106 avoid the association. Furthermore it was shown, that the NTD will react in opposition to other proteins on the increase of the ionic strength: the dissociation will be speeded up, and the association is not influenced. The identical behaviour was observed with the single ex-change of the other protonable amino acid side chains, except for the mutation of E119, which retards dissociation. Therefore the macromolecular dipol, that is formed by the charge distribution of the NTD, is obviously influencing the association. Glutamate receptors participate in the fast synaptic signal transfer in vertebrates. Here dif-ferent conformations of the ligand binding domain (LBD) have decisive effects on the function of the entire receptor. These have been investigated with a combination of photoin-duced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Using this method a dynamic behaviour of the bound and unbound form of the AMPA specific glutamate receptor 2 LBD was shown. Furthermore it was shown, that the dynamics will change differently in dependence of the binding of the agonist glutamate and AMPA, the partial agonist kainate or Cyclothiazide (CTZ), which effects a dimerization of the LBDs. This may have an effect on the function of the receptors. The use of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer formation and the pho-toinduced electron transfer in this thesis has shown, that these offer the opportunity to an-swer a large range of questions and open a view to the dynamic functionality of proteins. Combined with established fluorescence methods it is possible to quantitatively investigate kinetic rates at different time scales.

Protein-protein interactions play a crucial role in the development of drug delivery devices for the increasingly important biologicals, including antibodies, growth factors and cytokines. The understanding thereof might offer opportunities for tailoring carriers or drug proteins specifically for this purpose and thereby allow controlled delivery to a chosen target. The possible applications range from trigger-dependent release to sustained drug delivery and possibly permanently present stimuli, depending on the anticipated mechanism. Silk fibroin (SF) is a biomaterial that is suitable as a carrier for protein drug delivery devices. It combines processability under mild conditions, good biocompatibility and stabilizing effects on incorporated proteins. As SF is naturally produced by spiders and silkworms, the understanding of this process and its major factors might offer a blueprint for formulation scientists, interested in working with this biopolymer. The natural process of silk spinning covers a fascinating versatility of aggregate states, ranging from colloidal solutions through hydrogels to solid systems. The transition among these states is controlled by a carefully orchestrated process in vivo. Major players within the natural process include the control of spatial pH throughout passage of the silk dope, the composition and type of ions, and fluid flow mechanics within the duct, respectively. The function of these input parameters on the spinning process is reviewed before detailing their impact on the design and manufacture of silk based drug delivery systems (DDS). Examples are reported including the control of hydrogel formation during storage or significant parameters controlling precipitation in the presence of appropriate salts, respectively. The review details the use of silk fibroin to develop liquid, semiliquid or solid DDS with a focus on the control of SF crystallization, particle formation, and drug-SF interaction for tailored drug load. Although we were able to show many examples for SF drug delivery applications and there are many publications about the loading of biologics to SF systems, the mechanism of interaction between both in solution was not yet extensively explored. This is why we made this the subject of our work, as it might allow for direct influence on pharmaceutical parameters, like aggregation and drug load. In order to understand the underlying mechanism for the interaction between SF and positively charged model proteins, we used isothermal titration calorimetry for thermodynamic characterization. This was supported by hydrophobicity analysis and by colloidal characterization methods including static light scattering, nanoparticle tracking analysis and zeta potential measurements. We studied the effects of three Hofmeister salts – NaCl (neutral), NaSCN (chaotropic) and Na2SO4 (cosmotropic) – and the pH on the interaction of SF with the model proteins in dependence of the ratio from one to another. The salts impacted the SF structure by stabilizing (cosmotropic) or destabilizing (chaotropic) the SF micelles, resulting in completely abolished (cosmotropic) or strongly enhanced (chaotropic) interaction. These effects were responsible for different levels of loading and coacervation when varying type of salt and its concentration. Additionally, NaCl and NaSCN were able to prolong the stability of aqueous SF solution during storage at 25°C in a preliminary study. Another approach to influence protein-protein interactions was followed by covalent modification. Interleukin-4 (IL-4) is a cytokine driving macrophages to M2 macrophages, which are known to provide anti-inflammatory effects. The possibility to regulate the polarization of macrophages to this state might be attractive for a variety of diseases, like atherosclerosis, in which macrophages are involved. As these cases demand a long-term treatment, this polarization was supposed to be maintained over time and we were planning to achieve this by keeping IL-4 permanently present in an immobilized way. In order to immobilize it, we genetically introduced an alkyne-carrying, artificial amino acid in the IL-4 sequence. This allowed access to a site-specific click reaction (Cu(I)-catalyzed Huisgen azide-alkyne cycloaddition) with an azide partner. This study was able to set the basis for the project by successful expression and purification of the IL-4 analogue and by proving the availability for the click reaction and maintained bioactivity. The other side of this project was the isolation of human monocytes and the polarization and characterization of human macrophages. The challenge here was that the majority of related research was based on murine macrophages which was not applicable to human cells and the successful work was so far limited to establishing the necessary methods. In conclusion, we were able to show two different methods that allow the influence of protein-protein interactions and thereby the possible tailoring of drug loading. Although the results were very promising for both systems, their applicability in the development of drug delivery devices needs to be shown by further studies. / Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung von Freigabesystemen für die immer wichtiger werdenden Protein-Therapeutika, wie Antikörper, Wachstumsfaktoren und Zytokine. Das Verständnis dieser Mechanismen würde die Möglichkeit eröffnen, sowohl die Träger, als auch die zu verabreichenden Proteine so zu verändern und zu steuern, dass sie auf kontrollierte Weise an einem bestimmten Ort freigesetzt werden. Die Anwendungen hierfür reichen von Trigger gesteuerter Freisetzung, über verzögerte Freigabe bis zur permanenten Präsentation von Stimuli, abhängig davon was für die jeweilige Applikation gewünscht ist. Seidenfibroin (SF) ist ein Biomaterial, welches verschiedene positive Eigenschaften für die Anwendung als Trägermaterial in sich vereint, indem es unter sehr milden Bedingungen verarbeitet werden kann, gut biokompatibel ist und stabilisierend auf eingebettete Proteine wirken kann. Da SF in der Natur von Spinnen und Seidenraupen produziert wird, könnte das Verständnis dieses Prozesses, sowie seiner wichtigsten Faktoren eine Vorlage für die Formulierung dieses Biopolymers geben. Der natürliche Prozess des Seidenspinnens vereint eine faszinierende Vielfalt von Aggregatszuständen, die von kolloidalen Lösungen über Hydrogele bis hin zu festen System reichen. Die Übergänge zwischen diesen Zuständen sind in vivo sehr sorgfältig kontrolliert. Die Hauptfaktoren dieses Prozesses sind der pH-Wert während der Passage der Spinnlösung durch die Drüse, sowie die Art und Zusammensetzung der Ionen und die herrschenden Scherkräfte. Die Funktion dieser einzelnen Faktoren auf den Spinnprozess wurde recherchiert und wird beschrieben, bevor ihr Einfluss auf die Entwicklung und Herstellung von seidenbasierten Freigabesystemen untersucht wird. Es werden Beispiele vorgestellt, die die Kontrolle der Hydrogelbildung während der Lagerung untersuchen oder signifikante Parameter für die kontrollierte Präzipitation in Gegenwart bestimmter Salze zeigen. Der Review betrachtet den Einsatz von Seidenfibroin in der Entwicklung von flüssigen, halbfesten oder festen Freigabesystemen und legt besonderen Fokus auf die Kontrolle der SF Kristallisation, Partikelbildung und Interaktion mit dem Arzneistoff für steuerbare Beladung. Obwohl wir viele Beispiele für die Anwendung von SF in Freigabesystemen zeigen konnten und viele Publikationen die Beladung von Proteinen auf SF-Systeme behandeln, wurde der Mechanismus der Interaktion zwischen beiden bisher nicht detailliert untersucht. Es gibt wenige Studien die einige Aspekte abdecken, aber keines beschäftigte sich spezifisch mit dieser Fragestellung. Darum machen wir dies zum Gegenstand unserer Arbeit, da dies einen direkten Einfluss auf pharmazeutische Parameter, wie Aggregation und Beladung, erlauben würde. Um den zugrundeliegenden Mechanismus der Wechselwirkung zwischen SF und einem positiv geladenen Modellprotein zu verstehen, nutzten wir isotherme Titrationskalorimetrie für eine thermodynamische Charakterisierung. Diese wurde durch kolloidale Charakterisierungsmethoden wie Statische Lichtstreuung, nanoparticle tracking analysis und Zeta-potentialmessungen, sowie Hydrophobitätsbestimmungen unterstützt. Wir untersuchten die Effekte von drei verschiedenen Hofmeister Salzen - NaCl (neutral), NaSCN (chaotrop) und Na2SO4 (kosmotrop) – und des pH Wertes auf die Interaktion von SF mit dem Modellprotein in Abhängigkeit vom Verhältnis der beiden zueinander. Die Salze beeinflussten die SF Struktur, indem sie die SF Mizellen entweder stabilisierten (kosmotrop) oder destabilisierten (chaotrop) und dadurch die Interaktion entweder vollständig unterbanden (kosmotrop) oder verstärkten (chaotrop). Diese Effekte waren verantwortlich für verschiedene Level des Loadings und der Koazervation, wenn Salzart und –konzentration variiert wurden. Außerdem waren NaCl und NaSCN in der Lage die Stabilität einer wässrigen SF-Lösung während der Lagerung bei 25°C zu verlängern. Ein andere Ansatz um die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu beinflussen wurde mit kovalenter Modifikation verfolgt. Interleukin-4 (IL-4) ist ein Zytokin und kann Makrophagen zu M2 Makrophagen polarisieren, welche dann anti-inflammatorische Wirkungen haben. Die Möglichkeit diese Polarisation zu regulieren wäre für verschiedene Krankheiten, wie Arteriosklerose, bei denen Makrophagen eine Rolle spielen interessant. Da in diesen Fällen eine Langzeitbehandlung von Nöten ist sollte die Polarisation über die Zeit erhalten bleiben. Wir planten dies durch die Immobilisation von IL-4 zu erreichen, die für eine permanente Präsenz sorgen würde. Um IL-4 zu immobilisieren haben wir eine künstliche Aminosäure in die Sequenz eingeführt, die eine Alkingruppe trägt. Diese ermöglicht den Zugang zu einer Kupfer vermittelten, spezifischen Click-Reaktion (Cu(I)-catalyzed Huisgen azide-alkyne cycloaddition) mit einem Azid-Partner. Diese Studie war in der Lage die Basis für dieses Projekt zu erstellen, indem wir eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung des IL-4 Analogons leisten konnten und dieses sowohl erhaltene Bioaktivität als auch Verfügbarkeit für die Clickreaktion zeigte. Die andere Seite dieses Projekts bestand aus der Isolation von humanen Monozyten und der Polarisation und Charakterisierung von humanen Makrophagen. Die Herausforderung hierbei lag darin dass die meiste Forschung auf diesem Gebiet an murinen Makrophagen durchgeführt wurde und dies nicht auf humane Zellen übertragbar war, und die erfolgreiche Arbeit bisher, beschränkte sich auf die Etablierung der nötigen Methoden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in der Lage waren zwei verschiedene Methoden zur Beeinflussung der Protein-Protein Wechselwirkungen und damit der Beladung zu zeigen. Obwohl die Ergebnisse für beide Systeme vielversprechend waren muss ihre Anwendbarkeit in der Entwicklung von Freigabesystemen noch durch weitere Studien belegt werden.

Darmstadt, Techn. Universiẗat, Diss., 2007. / Dateien im PDF-Format.

Techn. Univ., Diss., 2010--München.

Universiẗat, Diss., 2004--Bonn. / Dateien in unterschiedlichen Formaten.

University, Diss., 2005--Düsseldorf.

Univ., Diss., 2006--Frankfurt (Main) / Zsfassung in engl. und dt. Sprache