Univ., Diss., 2009--Marburg.

Univ., Diss., 2009--Marburg.

Universiẗat, Diss., 2007--Würzburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2006.

Universiẗat, Diss., 2006--Würzburg.

Diese Dissertation beschreibt Methoden zur Lösung wichtiger anwendungsorientierter Aspekte des struktur- und ligandbasierten in-silico-Wirkstoffdesigns. Dabei liegt der Fokus auf der Entwicklung chemometrischer Verfahren und der Überprüfung ihrer Leistungsfähigkeit. Die vorgeschlagenen Algorithmen werden mit entsprechenden etablierten Techniken verglichen. Die folgenden Abschnitte fassen die Vorgehensweisen und Resultate in den einzelnen Projektbereichen zusammen. Identifizierung von Outliern. Die Untersuchung eines QSAR-Datensatzes mit dem Ziel der Outlier-Identifizierung wird in der Praxis häufig vernachlässigt. Dabei ist es offensichtlich, daß kein QSAR-Modell auf jede nur denkbare chemische Verbindung anwendbar sein kann. Vielmehr handelt es sich um empirische mathematische Modelle, die nur innerhalb jenes Datenraums Gültigkeit besitzen, der von den Trainingsobjekten aufgespannt wird. Daher ist jedes Modell auf gewisse Grenzen beschränkt, außerhalb derer eine verläßliche Vorhersage unmöglich ist. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode ODD dient der Ermittlung dieser Grenzen und damit der Identifizierung von Outliern, also Objekten außerhalb des Anwendungsbereichs des Modells. Ziel der Entwicklung war ein nur auf den unabhängigen Variablen (X-Daten) basierendes Verfahren, das auch auf hochdimensionaleDatensätze anwendbar ist undweitestgehend auf den Eingriff des Benutzers (etwa die Definition von Grenzwerten) verzichtet. Ebenfalls wünschenswert war die Fähigkeit zur Identifikation von Inliern. Eine ausreichend hohe Geschwindigkeit sollte die Einsetzbarkeit im virtuellen Screening gewährleisten. Die Methode mußte der Überprüfung standhalten, den Vorhersagefehler eines Modells bei Vorhandensein extremer Outlier zu reduzieren, gleichzeitig aber unkritische Datensätze unbeeinflußt zu lassen. ODD basiert auf der Beurteilung der euklidischen Distanz eines Testobjekts zu seinem am nächsten benachbarten Trainingsobjekt. Der Schwellenwert für die Betrachtung eines Objekts als Outlier wird dabei aus der Verteilung der Nächster-Nachbar-Distanzen der Trainingsobjekte berechnet. Durch dieses intrinsische Maß ergibt sich die gewünschte Dimensionsunabhängigkeit und vor allem die automatische Anpassung des Grenzwerts an die Charakteristik des Kalibrierdatensatzes ohne Eingriff des Benutzers. Die Validierung zeigt, daß ODD extreme Outlier zuverlässig erkennt und sich gleichzeitig durch eine im Vergleich zu anderen gebräuchlichen Verfahren geringere Anzahl falsch positiver Identifizierungen auszeichnet. Ensemble-Techniken. In einer vergleichenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit verschiedener Ensemble-Techniken hinsichtlich ihres Einflusses auf den Vorhersagefehler untersucht. Dazu wurden umfangreiche Simulationen anhand mehrerer realer QSAR-Datensätze durchgeführt. Die Verwendung von Ensembles (d. h. einer Sammlung vielerModelle, diemit geringfügigmanipulierten Varianten des Trainingsdatensatzes kalibriert wurden) wirkt sich im allgemeinen positiv auf den Vorhersagefehler (RMSEP) aus. Diese Reduzierung des RMSEP wurde hier ermittelt und für verschiedenen Ansätze zur Ensemble-Generierung verglichen. Insgesamt betrachtet erwiesen sich die Methoden der konvexen Pseudodaten und des Baggings als die effektivsten Verfahren zur Ensemble-Generierung, da sie den Vorhersagefehler am deutlichsten verbesserten. Die konvexen Pseudodaten wurden erstmalig zur Erzeugung von Ensembles in der QSAR-Analyse eingesetzt; sie werden als neuer Standard zur Reduzierung des RMSEP bei QSAR-Problemen vorgeschlagen, die Regressionsmodelle auf Basis von latenten Variablen verwenden. Darüber hinaus bieten die Studien eine Abschätzung dermit Hilfe von Ensembles zu erzielenden Reduktion des Vorhersagefehlers bei typischen QSAR-Datensätzen. Virtuelles Screening. Beim virtuellen Screening handelt es sich um eine Technik zum Durchsuchen großer (virtueller)Molekülbibliotheken—oftmehrere Millionen Verbindungen — nach den aussichtsreichsten Wirkstoffkandidaten. Dies kann sowohl durch strukturbasierte als auch mit Hilfe ligandbasierter Verfahren geschehen. Es wurden umfangreiche Simulationen anhand sechs verschiedener Targets und einer Bibliothek von mehr als 90 000 Molekülen durchgeführt, um das Potential strukturbasierter (Docking mit FLEXX) und ligandbasierter (Ähnlichkeitssuchemitmehreren Referenzen) Verfahren zu vergleichen. Darüber hinauswurde durch Berechnung von Interaktionsfingerprints eineMöglichkeit geschaffen, die Information der beiden sonst getrennten Herangehensweisen zu kombinieren. Um den Einfluß des Klassifizierungsalgorithmus zu untersuchen, wurden verschiedene statistische Methoden zur Datenauswertung herangezogen. Als Bewertungskriterium für die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens diente jeweils die Anzahl der wiedergefundenen aktiven Moleküle in der simulierten Screeningdatenbank. Die Resultate führen zu dem Schluß, daß ligandbasierte Verfahren, die einfacher einzusetzen sind aber mehr a-priori -Information benötigen, dem strukturbasierten virtuellen Screening hinsichtlich der Datenbankanreicherung überlegen sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, wie nutzbringend die Zusammenführung von strukturbasierter Information und solcher über das Interaktionsmuster bekanntermaßen aktiver Verbindungen für die Erhöhung der Wiederfindungsrate ist. Bei der Datenanalyse stellte sich heraus, daß im Mittel bestimmte statistische Methoden (minimale euklidische Distanz ED/Min bzw. Tanimoto-Ähnlichkeit der Integer-Fingerprints Int/Min) zu bevorzugen sind. Kovalentes Docking von Cathepsin-Inhibitoren. Die Cysteinproteasen Cathepsin B und L sind interessante pharmakologische Targets. Geeignete Inhibitoren stammen u. a. aus der Strukturklasse der Aziridine. Ein nukleophiler Angriff des Cysteinrests des Enzyms auf den elektrophilen Aziridinring führt hier zur Ausbildung einer kovalenten Ligand-Rezeptor-Bindung. Praktisch alle erhältlichen Dockingprogramme konzentrieren sich jedoch auf nicht-kovalente Ligand-Rezeptor-Interaktionen und lassen kein uneingeschränktes kovalentes Docking zu. Daher wurde für FLEXX ein Dockingprotokoll entworfen, das den entscheidenden nicht-kovalenten Zustand vor Ausbildung der kovalenten Bindung simulieren kann. Auf dieseWeise konnte untersucht werden, ob sich die Reaktionszentren von Ligand und Enzym ausreichend nahe für die Ausbildung einer kovalenten Bindung kommen. Der vorgestellte Ansatz läßt sich leicht auf andere kovalente Ligand-Rezeptor- Systeme übertragen und bietet somit eine breite Anwendbarkeit. Weiterhin wurde die Parametrisierung der in FLEXX vorgesehenen Interaktionsgeometrien an die strukturellen Eigenheiten der zu dockenden Aziridide angepaßt. Diese weisen nämlich formal eine Amidbindung auf, deren geometrische und elektronische Eigenschaften jedoch deutlich von den Werten eines typischen Amids abweichen. Die Ergebnisse der Dockingstudien liefern wertvolle Einblicke für das Verständnis der Selektivität der untersuchten Liganden bezüglich Cathepsin B beziehungsweise L. Umgekehrt erbringt die gute Übereinstimmung der FLEXX-Resultate mit den experimentell bestimmten Inhibitionskonstanten den Nachweis für die Validität des verwendeten Dockingprotokolls. / This thesis describes methods for solving important application-oriented aspects of structure-based and ligand-based in silico drug design. The proposed algorithms are compared to well established techniques. The focus is particularly on the development and benchmarking of different chemometric techniques. In the following, the approaches and results within the different project areas are summarised. Outlier Identification. The inspection of QSAR datasets in order to identify prediction outliers is often omitted in practice. However, it is clear that no QSAR model is applicable to every conceivable chemical compound. Since QSAR models represent empirical mathematical models, these are only valid within the data space spanned by the training data. Hence, every model is restricted to certain borders beyond which a reliable prediction is impossible. The method ODD developed in this work can be used to determine these borders and thus to identify outliers. Those are objects outside the data space spanned by the training data (i.e. the applicability domain of the model). The aim of the method is to detect outliers solely based on the predictor variables (X data). Moreover, the method must be capable to handle high-dimensional datasetswithminimal user interference (e.g. setting of cut-offs). Furthermore, the ability to identify inliers would be preferable. The computational speed should be high enough to apply the method to virtual screening. The developed technique had to prove that it provides a reduction of the model’s error of prediction if extreme outliers are present. At the same time, it should leave non-critical datasets unaffected. ODD is based on the evaluation of the Euclidean distance of a test object towards its nearest neighbouring training object. The cut-off for deeming an object as outlier is calculated from the distribution of the nearest neighbour distances of the training set. This intrinsic value leads to the desired independence from data dimensionality and, above all, to an automatic adjustment of the cut-off to the characteristics of the calibration dataset without any user intervention. The validation shows that ODD reliably identifies extreme outliers. On the other hand, it offers a low rate of false positives compared to other common techniques for outlier identification. Ensemble Techniques. In a benchmark study, the impact of different ensemble techniques on the prediction error was investigated. For this purpose, comprehensive simulations on several real QSAR datasets were carried out. The application of ensembles (i.e. a collection of many models trained with sligthly perturbed versions of the training set) usually lowers the error of prediction (RMSEP). The RMSEP reduction was determined and compared for different approaches of ensemble generation. Overall, the methods of convex pseudo data and bagging proved to be the most efficient ways for ensemble generation (i.e. they resulted in the largest reduction of the prediction error). Convex pseudo data, which were applied toQSAR data sets for the first time as ensemble technique, are proposed as the new standard for lowering RMSEP in QSAR problems using latent variable regression models. Furthermore, the effect size of ensemble averaging was quantified for typical QSAR data sets. Virtual Screening. Virtual screening is a technique to screen large (virtual) molecular databases — often several million compounds — for the most promising drug candidates. This can be done by structure-based as well as by ligand-based approaches. Comprehensive computations on six different targets and a library of more than 90 000 compounds were carried out to compare the potential of structure-based techniques (docking with FLEXX) and ligand-based techniques (similarity searching with multiple queries). In addition to that, interaction fingerprints were computed in order to combine the information of the otherwise distinct approaches. Several statistical methods were applied for data analysis to investigate the impact of the machine learning algorithm. Figure of merit for each approach was the number of active compounds retrieved from the assembled screening database with known actives. The results lead to the following conclusions: Ligand-based approaches, which are simpler to use but require more a priori information, turned out to be superior to structure-based virtual screening techniques in terms of database enrichment. In addition, it could be shown that combination of structure-based information with information of the interaction pattern of known actives is beneficial for increasing retrieval rates. Data analysis revealed that certain statistical methods (minimum Euclidean distance ED/Min, and Tanimoto similarity of integer fingerprints Int/Min, respectively) are on average to be preferred. Covalent Docking of Cathepsin Inhibitors. Cysteine proteases Cathepsin B and L are interesting pharmacological targets. Suitable inhibitors, amongst others, come from the structural class of aziridines. A nucleophilic attack of the enzyme’s active site cysteine moiety on the electrophilic aziridine ring leads to formation of a covalent bond between ligand and receptor. However, virtually all available docking programs concentrate on noncovalent ligand-receptor interactions and do not provide sophisticated, unrestricted covalent docking. Thus, a docking protocol for FLEXX was designed which is able to represent the essential non-covalent state before formation of the covalent bond. That way, it could be studied whether or not the reaction centres of both ligand and receptor adopt a position close enough to each other to actually form the covalent bond. The approach presented here can easily be transferred to other covalent ligand-receptor systems and therefore provides a broad applicability. Furthermore, the parametrisation of the FLEXX interaction geometries was adapted to account for the special structural features of aziridides. Those show a formal amide bond, but its geometric and electronic properties differ noticeably from a typical amide. The results of the docking studies provide valuable insights for understanding the Cathepsin B/L selectivity of the ligands under scrutiny. Vice versa, the good correspondence of the FLEXX results and the inhibition constants obtained experimentally provide evidence for the validity of the applied docking protocol.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung, Validierung und erfolgreiche Anwendung der interpretierbaren 4D-QSAR Methodik xMaP. Die neue Methode benötigt weder die Auswahl des vermuteten bioaktiven Konformers noch eine Überlagerung der Moleküle im Raum, sie ist also alignment-frei. xMaP ist invariant gegenüber Rotation, Translation und kodiert die Flexibilität der Moleküle. Dadurch wird der Einfluss durch den Benutzer praktisch ausgeschaltet. / This thesis describes the development, validation and successful application of the interpretable 4D-QSAR technique xMaP. The novel method does neither rely on the selection of a presumed bioactive conformer nor on a spatial superimposition of the molecules which means that it is so-called alignment-free. Put differently, xMaP is invariant to rotation and translation and encodes the flexibility of the molecules under scrutiny. By combining these features a possible user bias is almost completely eliminated.

Univ., Diss., 2009--Marburg.

München, Techn. Univ., Diss., 2003.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Durchführung computergestützter Untersuchungen an den Wildtyp-Kristallstrukturen dieses Enzyms – einerseits zur Suche nach neuen Inhibitoren im Rahmen von virtuellen Screening- (VS-) Studien, andererseits zur Charakterisierung der strukturellen Flexibilität mit Hilfe von Molekulardynamik- (MD-) Simulationen. Für ein erstes VS wurde zunächst eine Datenbank von mehreren Millionen kommerziell erhältlichen Verbindungen mit Arzneistoff-ähnlichen physikochemischen Eigenschaften erstellt. Als Ausgangspunkt der Screening-Studie diente ein Teildatensatz, welcher mit Hilfe eines auf dem nativen Bindemodus des KasA-Inhibitors Thiolactomycin (TLM) beruhenden Pharmakophormodells erhalten wurde. Diese Verbindungen wurden in die Bindetasche von KasA gedockt und die Qualität der erhaltenen Posen in einem Re- und Konsensus-Scoring-Verfahren bewertet. Schließlich wurden 14 Substanzen käuflich erworben und im Rahmen einer Fluoreszenz-Bindungsstudie experimentell getestet. Für sechs Moleküle war gegenüber KasA eine schwache, zu TLM vergleichbare Aktivität zu verzeichnen. Eine zweite VS-Studie befasste sich mit der Bewertung der Bindungsaffinität synthetisch leicht zugänglicher Derivate von GS95, einem gegenüber dem KasA-Wildtyp aktiven Molekül mit einer 1-Benzyluracil-Grundstruktur. Anhand geeigneter Synthesebausteine wurde eine virtuelle Datenbank von insgesamt 16 Derivaten erstellt, welche in die Bindetasche des Enzyms gedockt wurden. Für die vorhergesagten Bindemodi erfolgte dann eine Abschätzung der freien Bindungsenthalpie. Nach einer Bewertung der Orientierungen auf Basis der errechneten ΔG-Werte sowie einer visuellen Analyse wurden schließlich elf Verbindungen synthetisiert und im Fluoreszenz-Experiment getestet, wobei für alle Uracilderivate eine Aktivität zu beobachten war. Die Kd-Werte fallen jedoch ähnlich hoch aus wie bei GS95. Zur Untersuchung der Strukturdynamik des KasA-Wildtyps wurden drei MD-Simulationen des homodimeren Proteins von je 15 ns Länge durchgeführt. Mit Hilfe von 2D-RMSD-Berechnungen und einer hierarchischen Clusteranalyse wurden aus den drei Simulationen insgesamt zehn repräsentative Snapshots entnommen, welche die im Rahmen der Simulationszeit von insgesamt 90 ns produzierte strukturelle Vielfalt der Bindetasche von KasA wiedergeben. Wie die Analysen zeigen, wird ein dualer Charakter hinsichtlich der Flexibilität der unmittelbaren Taschenreste beobachtet. Hierbei zeigt Phe404 eine besonders ausgeprägte strukturelle Vielfalt; diese Beobachtung deckt sich mit der gatekeeper-Rolle der Aminosäure zwischen der Malonyl-Bindetasche und dem Acyl-Bindekanal, welcher für die Unterbringung der wachsenden Fettsäurekette im Enzym während der Katalyse verantwortlich zeichnet. Darüber hinaus erklärt die hohe Flexibilität von Phe404 möglicherweise die recht schwache Bindungsaffinität von TLM gegenüber dem Wildtyp von KasA, da die gatekeeper–Aminosäure nur in der geschlossenen Form einen stabilisierenden Effekt auf den Liganden ausübt. Besondere Bedeutung kommt hierbei einem Wassermolekül zu, welches als eine Art molekularer Schalter für die Flexibilität von Phe404 betrachtet werden kann und somit die Fixierung von TLM in der Bindetasche maßgeblich beeinflusst. Des Weiteren wurden innerhalb der Tasche hohe Besetzungsraten für je ein Wassermolekül identifiziert. Die aus den MD-Simulationen gewonnenen Erkenntnisse wurden anschließend zur Aufstellung von Empfehlungen für das Design neuartiger KasA-Inhibitoren verwendet. Des Weiteren wurde die Dynamik des oben erwähnten Acyl-Bindekanals, welcher sich aus den Aminosäuren 115-147 zusammensetzt, näher charakterisiert. Hierbei wurden die Reste 115-119 und insbesondere Leu116 als zweiter gatekeeper identifiziert, welcher die Öffnung des Acyl-Bindekanals zur Oberfläche des Proteins reguliert und somit eine entscheidende Funktion bei der Unterbringung der langkettigen Fettsäuresubstrate übernimmt. Schließlich wurden zwei repräsentative Bindetaschenkonformationen aus den MD-Simulationen hinsichtlich einer Verwendung in strukturbasierten VS-Studien näher untersucht. Mit Hilfe von hot spot Analysen und unter Berücksichtigung oben genannter Empfehlungen für das Design neuartiger KasA-Inhibitoren wurden verschiedene Pharmakophormodelle erstellt, welche nach Durchsuchung der zu Anfang dieses Kapitels erwähnten virtuellen Moleküldatenbank zwischen 149 und 420 verschiedene hit-Strukturen lieferten. Folglich scheint eine Adressierung der beiden Konformationen durch arzneistoffartige Verbindungen prinzipiell möglich. Unter den erhaltenen Verbindungen herrscht eine hohe strukturelle Vielfalt; außerdem unterscheiden sich diese im Allgemeinen deutlich von den Molekülen aus den vorangegangenen VS Studien, was das Potential der beiden Bindetaschenkonformationen zur Identifizierung von potentiellen KasA-Inhibitoren mit neuartigen Grundstrukturen zum Ausdruck bringt. / In the present study, computer-based investigations were applied to the wildtype crystal structures of this enzyme – on one hand, to identify new inhibitors in virtual screening (VS) studies and, on the other, to gather information about the dynamic behavior of KasA by means of molecular dynamics (MD) simulations. In a first VS, an in silico database containing several millions of commercially available drug-like compounds was built. This collection was screened via a pharmacophore model following the native binding mode of the KasA inhibitor thiolactomycin (TLM. The resulting subset then served as starting point for consequent docking studies and the predicted binding modes within the catalytic pocket of the protein were ranked by a re- and consensus-scoring approach. After additional visual inspection, 14 compounds were purchased and tested by means of direct binding fluorescence titrations. Six substances turned out to be active, even though only moderate dissociation constants similar to the data obtained for TLM (244.7 µM / 255.0 µM) were observed. In a second VS approach, the binding affinity was assessed for readily synthesizeable analogues of GS95, a 1 benzyluracil derivative showing an activity of 107.2 µM against wildtype KasA in the above mentioned fluorescence experiments. Based on appropriate building blocks which were in stock at the laboratory of Prof. Holzgrabe’s working group, a virtual library of 16 benzyl- and phenylethyluracil derivatives was created. The molecule structures were docked to the active site of KasA and the free energy of binding was estimated for the generated poses. By means of the ΔG values and visual analysis, a total of eleven compounds were selected to be synthesized and experimentally tested. All substances proved active in the fluorescence assay, yet showed only Kd values comparable to GS95. Moreover, no correlation was observed between experimentally determined and predicted free energies of binding. To probe the dynamic behavior of wildtype KasA (PDB codes 2WGD and 2WGE), three 15-ns MD simulations were performed of the homodimeric. By means of 2D RMSD calculations and a hierarchical cluster analysis, ten representative snapshots were extracted, reflecting the con-formational space of the binding pocket over a timescale of 90 ns in total. The analysis reveals a dual nature of the binding pocket in terms of flexibility. While the residues of the catalytic triad, Cys171, His311, and His345, plus Phe237, constitute the rather rigid part, a more flexible behavior is observed for the remaining residues. Among those, Phe404 presents the largest conformational alterations, which complies with its known role as a gatekeeper between the active site and the acyl-binding channel that accommodates the long-chain fatty acid substrates during catalysis. Furthermore, the high flexibility of Phe404 may account for the weak binding affinity of TLM to wildtype KasA, as only closed conformations of the gatekeeper side chain turned out to have a stabilizing effect on the ligand. In this regard, a water molecule between Ala209 and Ser138 was found to be of functional relevance, acting as a molecular switch that toggles the flexible behavior of the Phe404 side chain and, thereby, the fixation of TLM in the binding pocket. Also, high occupancy rates for a water molecule were registered at two positions within the active. Following the above findings, suggestions for the design of new KasA inhibitors were derived. Furthermore, the dynamics of the aforementioned acyl-binding channel comprising residues 115 147 were analyzed. Residues 115 119 and, in particular, Leu116 were identified as a second gatekeeper which regulates the opening between the acyl channel and the outside of the protein. Finally, two representative MD-snapshots of the binding were further examined in terms of their applicability in structure-based VS studies. Using hot-spot analyses and taking account of the above suggestions for the design of new KasA inhibitors, different pharmacophore models were created and applied to the virtual database mentioned at the beginning of this summary. The searches yielded between 149 and 420 different hit compounds, which indicates that addressing BK1 and BK2 by drug-like molecules is, in principle, possible. A fingerprint-based cluster analysis revealed a high structural diversity among the hits which, in general, also differ significantly from the scaffolds found in the two previous VS studies, pointing out the potential value of the two binding-pocket conformations for identifying putative KasA inhibitors with novel scaffolds.

Tübingen, University, Diss., 2005 (Nur beschränkt für den Austausch).