Tübingen, Univ., Diss., 2004.

Braunschweig, Techn. Univ., Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Berlin, Freie Univ., Diss., 2002. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Computerdatei im Fernzugriff.

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Braunschweig, Techn. Universiẗat, Diss., 2003.

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Bei Verletzung einer Gefäßwand kommen Blutplättchen in Kontakt mit den Substanzen des Subendothels; Die Plättchen werden dadurch aktiviert, sie aggregieren und verschließen die Wunde, wodurch ein hoher Blutverlust verhindert wird. Unter pathologischen Bedingungen, bei Aufbrechen eines artherosklerotischen Plaques an der Gefäßwand, können sich jedoch große Plättchenaggregate, die Thromben, formen, die das Gefäß verschließen, den Blutfluss stoppen und somit zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen können. Die kontrollierte Regulation und Signaltransduktion von bzw. durch Plättchenoberflächenrezeptoren ist wesentlich für das Funktionieren der Zellen und die intakte Balance zwischen physiologischer Plättchen-Aktivierung und der pathologischen Bildung eines Thrombus. In der vorliegenden Arbeit wird über wichtige Aspekte dieser Signalwege, die in drei Unterprojekten untersucht worden sind, berichtet. In dem ersten Unterprojekt wurde die Regulation von Plättchenoberflächenrezeptoren, den Glykoproteinen (GP) V und VI, bei Mäusen analysiert. Hier wird beschrieben, dass GPV und GPVI von der Plättchenoberfläche durch Metalloproteinasen geschnitten werden. Während physiologischer Stress, wie das Entkoppeln der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien, das Schneiden von GPVI durch eine unbekannte Proteinase auslöst, verursacht die Aktivierung von Plättchen mit bestimmten Agonisten das Schneiden von GPV. Die dafür verantwortliche Metalloproteinase wurde als ADAM17 identifiziert. In dem zweiten Unterprojekt wurde die Rolle der Protein Kinase C (PKC) in der Plättchenaktivierung einerseits und in der Plättchen pro-koagulanten Aktivität andereseits untersucht. Die Konformationsänderung/Aktivierung von alphaIIbeta3-Integrinen und Sekretion von Granula sind charakteristisch für die Plättchenaktivierung. Calcium-(Ca2+)-abhängige Phosphatidylserin (PS)- Expression auf der Plättchenoberfläche hingegen ist kennzeichnend für die pro-koagulante Aktivität. Der Beitrag von PKC zu den beschriebenen Plättchenzuständen war bisher unklar. In diesem Projekt wurde zum ersten Mal gezeigt, dass PKC eine doppelte Funktion in den Plättchen besitzt: einerseits fördert PKC die Plättchen-Aktivierung und –Aggregation, andererseits unterdrückt PKC die pro-koagulant Aktivität. In dem dritten Unterprojekt wurde die Rolle der kleinen GTPase Rac1 in der Plättchen- Aktivierung und -Aggregation in vitro und in vivo an konditionalen Rac1 Mäusen analysiert. Es wird berichtet, dass Rac1 für die GPVI abhängige Aktivierung von alphaIIbbeta3-Integrinen und dem Freisetzen von Ca2+ in der Zelle, notwendig ist, sowie für GPVI abhängige Plättchen-Aggregation und Thrombus Bildung. Hiermit wird die GTPase Rac1 zum ersten Mal in den Signalweg unterhalb von GPVI eingeordnet und ihr zudem dort eine essentielle Rolle zugeteilt. / Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI.

Ca2+-empfindliche K+-Kanäle mittlerer Leitfähigkeit (IK1-Kanäle) übernehmen wichtige Funktionen bei vielen physiologischen Prozessen wie z.B. bei der Zell-Proliferation, der epithelialen Salz- und Wasser-Sekretion und der Zellmigration. Die Kanäle werden durch die intrazeluläre Ca2+-Konzentration reguliert, wobei ihre Ca2+-Sensitivität durch Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des aus transformierten Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) klonierten Ca2+-sensitiven K+-Kanals mittlerer Leitfähigkeit (cIK1) und die Untersuchung seiner Regulierung durch die Proteinkinase C (PKC). Dazu wurde der Kanal heterolog in CHO- und HEK293-Zellen exprimiert. Seine biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie der Einfluß der Proteinkinase C auf die Kanalaktivität wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die cIK1-Ströme sind schwach einwärtsrektifizierend, zeigen keine Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetik und weisen im physiologischen Bereich keine Spannungsabhängigkeit auf. Der cIK1 ist K+-selektiv und wird durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert. Der Kanal wird durch Barium, Charybdotoxin und Clotrimazol blockiert und durch 1-Ethyl-2-Benzimidazolon aktiviert. Die funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften des klonierten cIK1 entsprechen damit denen des nativen Kanals aus MDCK-F-Zellen und stimmen mit denen anderer Mitglieder der IK1-Kanalfamilie überein. Neben der Regulierung durch die intrazelluläre Ca2+-Konzentration wird der cIK1 auch durch eine PKC-abhängige Phosphorylierung reguliert. Sowohl ATP als auch ATP?S stimulieren die Kanalaktivität. Die ATP-abhängige Aktivierung wird durch Inhibitoren der Proteinkinase C (Bisindolylmaleimid, Calphostin C) gehemmt, während die mit ATP?S induzierte Kanalaktivität weitgehend resistent gegen diese PKC-Inhibitoren ist. Eine Stimulierung der Proteinkinase C mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) führt zu einer sofortigen Aktivierung des cIK1. Im Gegensatz dazu sind die cIK1-Kanäle nach fast vollständigem Abbau der Proteinkinase C durch eine langfristige Inkubierung der Zellen mit PMA nicht mehr aktiv. Um zu untersuchen, ob diese Regulierung eine direkte Interaktion der Proteinkinase C mit dem Kanalprotein erfordert, wurden die drei putativen PKC-Konsensussequenzen des cIK1 mittels zielgerichteter Mutagenese so verändert, daß eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr möglich ist. Weder die einzelne Mutation der PKC-Konsensussequenzen (T101, S178, T329) noch die gleichzeitige Mutation aller drei Phosporylierungsstellen zu Alanin beeinflußt die akute Regulierung des cIK1 durch die Proteinkinase C. Die cIK1-Mutante T329A und die Dreifachmutante reagieren jedoch nach einem Abbau der Proteinkinase C mit einem extremen Anstieg der Kanalaktivität und demaskieren damit einen zweiten Weg der Kanalregulierung. Die Ergebnisse zeigen, daß der cIK1 durch zwei voneinander unabhängige Mechanismen reguliert wird. Eine PKC-abhängige Phosphorylierung erhöht die Aktivität der Kanäle, findet jedoch nicht an den bekannten PKC-Konsensusesquenzen des Kanalproteins statt. Dagegen werden die cIK1-Kanäle über einen zweiten ATP-abhängigen Mechanismus, der wahrschenlich eine direkte Interaktion mit dem Kanalprotein erfordert, gehemmt. / Ca2+ sensitive K+ channels of intermediate conductance (IK1 channels) are required for many physiological functions such as cell proliferation, epithelial transport or cell migration. The intracellular Ca2+ concentration is the most important regulator of IK1 channels. Their Ca2+ sensitivity can be modified by phosphorylation-dependent reactions. The aim of this study was the functional characterisation of the canine isoform cIK1 cloned from transformed renal epithelial cells (MDCK-F cells) and the investigation of mechanisms by which it is regulated by protein kinase C (PKC). cIK1 channels were heterologously expressed in CHO and HEK293 cells and investigated by means of patch clamp technique. cIK1 channels elicit a K+ selective, inwardly rectifying, and Ca2+-dependent current. It is inhibited by barium, charybdotoxin, clotrimazole, and activated by 1-ethyl-2-benzimidazolone. The electrophysiological and pharmacological characteristics thereby correspond to those of native cIK1 channels from MDCK-F cells and those of other IK1 channel isoforms. CIK1 channel are regulated by the intracellular Ca2+ concentration and in addition by protein kinase C. They are activated by the intracellular application of ATP or ATP?S. ATP-dependent activation is reversed by protein kinase C inhibitors (bisindolylmaleimide, calphostin C), while stimulation with ATP?S resists protein kinase C inhibition. Stimulation of protein kinase C with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) leads to the acute activation of cIK1 currents. In contrast, PKC depletion by overnight incubation with PMA prevents ATP-dependent cIK1 activation. To investigate whether this regulation requires a direct interaction with the channel protein, the three putative protein kinase C phosphorylation sites were mutated, so that the channel protein would no longer be phosphorylated at those residues. Neither single mutations nor the simultaneous mutation of all protein kinase C phosphorylation sites (T101, S178, T329) to alanine alter the acute regulation of cIK1 channels by protein kinase C. However, current amplitudes of the cIK1 mutant T329A and the triple mutant are dramatically increased upon logterm treatment with PMA. These mutations thereby disclose an inhibitory effect on cIK1 current of protein kinase C phosphorylation site at T329. Our results indicate that cIK1 activity is regulated in two ways. Protein kinase C dependent activation of cIK1 channels occurs indirectly, while the inhibitory effect probably requires a direct interaction with the channel protein.

Ulm, Univ., Diss., 2008.