BACKGROUND. Prostate cancer (PCa) remains a major health concern in men of the Western World. However, we still lack effective diagnostic tools a) for an effective screening with both high sensitivity and specificity, b) to guide biopsies and avoid histology sampling errors and c) to predict tumor aggressiveness in order to avoid overtreatment. Therefore, a more reliable, highly cancer-specific and ideally in vivo approach is needed. The present study has been designed in order to further develop and test the method of "metabolomic imaging" using magnetic resonance spectroscopy (MRS) at 7T to address those challenges. METHODS. Thirty whole prostates with biopsy-proven PCa were in vitro analyzed with a 7T human MR scanner. A voxel grid containing the spectral information was overlaid with the MR image of the middle transverse cross-sectional plane of each case. Subsequent histopathological evaluation of the prostate specimen followed. After the spectral output was processed, all voxels were compared with a metabolomic PCa profile, which had been established within a preliminary study, in order to create a metabolomic map indicating MRS cancer-suspicious regions. Those regions were compared with the histologically identified tumor lesions regarding location. RESULTS. Sixty-one percent of the histological cancer lesions were detected by metabolomic imaging. Among the cases with PCa on the examined slice, 75% were identified as cancerous. None of the tested features significantly differed between detected and undetected cancer lesions. A defined "Malignancy Index" (MI) significantly differentiated between MRS-suspicious lesions corresponding with a histological cancer lesion and benign lesions (p = 0.006) with an overall accuracy of 70%. The MI furthermore showed a positive correlation with the Gleason grade (p = 0.021). CONCLUSION. A new approach within PCa diagnostics was developed with spectral analysis including the whole measureable metabolome - referred to as "metabolomics" - rather than focusing on single metabolites. The MI facilitates precise tumor detection and may additionally serve as a marker for tumor aggressiveness. Metabolomic imaging might contribute to a highly cancer-specific in vivo diagnostic protocol for PCa. / Diese Studie befasst sich mit der Diagnostik von Prostatakarzinomen mittels metabolomischer Bildgebung auf Grundlage der Magnetresonanzspektroskopie. An dreißig Organen mit gesichertem Prostatakarzinom wurde nach Prostatektomie in vitro ein Magnetic-Resonance-Spectroscopy-Imaging (MRSI)-Scan mit 7T durchgeführt. Die Auswertung der prostatischen Spektren erfolgte mittels eines in einer Vorstudie definierten Prostatakrebs-Profils, das die metabolomischen Daten des gesamten messbaren Metaboloms einbezog. Die Ergebnisse der metabolomischen Bildgebung wurden anschließend mit denen der histologischen Untersuchung nach dem MRSI-Scan verglichen. 61% der histologisch nachgewiesenen Krebsläsionen konnten mittels der metabolomischen Bildgebung detektiert werden. Ein "Malignancy Index" unterschied signifikant zwischen malignen MRSI-Läsionen sowie den falsch Positiven. Er dient nachweislich als möglicher Marker für Tumoraggressivität. Mit der metabolomischen Bildgebung wurde ein Verfahren vorgestellt, das hochspezifisch für das Prostatakarzinom ist, eine Tumorlokalisation vor Biopsieentnahme ermöglicht sowie eine Abschätzung der Tumoraggressivität und möglichen Progression erlaubt. Dennoch sind weitere Studien erforderlich, um das Verfahren sowie insbesondere die Sensitivität zu verbessern.

Als Hilfsstoffe in der Arzneimittelentwicklung können Cyclodextrine und ihre Derivate aufgrund der Fähigkeit zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen mit organischen Molekülen zu unterschiedlichsten Zwecken verwendet werden. Ein Verständnis aller Einflussfaktoren auf die Komplexbildung wäre von großem Wert, weil man so gegebenenfalls vorab entscheiden könnte, ob ein Einsatz von Cyclodextrinen überhaupt in Betracht käme, und wenn ja, welches Cyclodextrin den beabsichtigten Effekt brächte. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe verschiedener Methoden Informationen zu den Einschlusskomplexen gesammelt, die natürliche Cyclodextrine mit einer Reihe typischer Arzneistoffmoleküle bilden. Als Modellsubstanzen wurden die Sulfonamide Sulfadiazin, Sulfadimidin, Sulfafurazol, Sulfaguanidin, Sulfamerazin, Sulfameter, Sulfamethoxazol, Sulfanilamid und Sulfathiazol gewählt. Aufgrund ihrer Molekülgröße bilden die gewählten Gäste in wässriger Lösung bevorzugt mit dem siebengliedrigen β-Cyclodextrin Komplexe, die Wechselwirkungen sind im Vergleich mit anderen Gastmolekülen jedoch relativ schwach. Im Rahmen von Löslichkeitsstudien wurden verschiedene Einflüsse (pH, Temperatur) auf die Komplexbildung in Lösung untersucht. Mit Hilfe von Van’t Hoff Plots wurden die thermodynamischen Größen der Komplexbildung bestimmt, wo das Phänomen der Enthalpie-Entropie-Kompensation beobachtet werden konnte. Die Stöchiometrie der Komplexe wurde unter anderem in Job’s Plots mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Komplexbildung geht im Fall der Sulfonamide meist nicht nur mit einer Löslichkeitssteigerung des Gastes, sondern auch des nur eingeschränkt wasserlöslichen β-Cyclodextrins einher. Dieser Effekt wurde bei verschiedenen pH-Werten quantifiziert und tritt bei allen Gastmolekülen, mit Ausnahme von Sulfathiazol, in vergleichbarem Umfang auf. Unter Ausnutzung dieses Phänomens kann je nach Gast eine Konzentration des Wirtes in Lösung erreicht werden, die ein Vielfaches seiner intrinsischen Löslichkeit beträgt. Sowohl in Lösung als auch im Feststoff wurde die Struktur der Einschlusskomplexe mit spektroskopischen Verfahren untersucht. ROESY-Spektren zeigten, dass die chemisch sehr ähnlichen Gastmoleküle teilweise erheblich von einander abweichende Positionen und Orientierungen in der Kavität des Cyclodextrins einnehmen. FTIR-Spektren fester Komplexzubereitungen unterstützen die detaillierteren NMR-Ergebnisse für die meisten Gäste. Ergänzend wurden mit Hilfe von molekularmechanischen Methoden theoretisch plausible Komplexstrukturen erstellt. Dabei wurde die Flexibilität der Cyclodextrinmoleküle und das mögliche Auftreten eines induced-fit durch die Generierung verschiedenartiger Konformere des β-Cyclodextrins in einer Molekulardynamikstudie berücksichtigt. In Dockingstudien (Autodock 3.0) wurde nach dem Bindungsmodus gesucht. Unter den Versuchsbedingungen dominieren Orientierungen, bei denen die aromatische Aminogruppe und die schwefelgebundenen Sauerstoffatome mit den Hydroxylgruppen des Wirtes Wasserstoffbrückenbindungen aufbauen können. Die resultierende Störung der intra- und intermolekularen Wechselwirkungen des Cyclodextrins stellt eine mögliche Erklärung der synergistischen Löslichkeitseffekte zwischen Wirt und Gast dar. Die gewonnenen Daten stellen eine Grundlage zur Charakterisierung der Komplexbildung von Sulfonamiden mit natürlichen Cyclodextrinen dar. Alle Modellsubstanzen wurden mit denselben Methoden untersucht, was eine vergleichende Betrachtung ermöglicht. Insgesamt wurde durch die Betrachtung einer so großen Gruppe an Modellsubstanzen ähnlicher chemischer Eigenschaften und Molekülstruktur ein Eindruck gewonnen, wie stark die Vorgänge bei der Komplexbildung mit Cyclodextrinen schon innerhalb einer relativ homogenen Gruppe variieren können. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist zu folgern, dass Vorhersagen zur Komplexbildung mit Cyclodextrinen anhand von Untersuchungen mit vergleichbaren Modellsubstanzen nicht endgültig zu treffen sind, sondern immer von einem vom Gastmolekül abhängigen Einzelfall auszugehen ist. / Cyclodextrins and their derivatives with their ability to form host-guest-complexes with organic molecules can be applied for various purposes in drug development. Understanding all effects on complex formation one could be able to predict if the use of cyclodextrins is indicated and which cyclodextrin is appropriate. In this thesis various methods were applied to gather information about complexes formed by natural cyclodextrins and a set of typical drug molecules. Sulfa drugs - sulfadiazine, sulfadimidine, sulfafurazole, sulfaguanidine, sulfamerazine, sulfameter, sulfamethoxazole, sulfanilamide and sulfathiazole - were chosen as model substances. Owing to their molecular size these guests form complexes preferably with β-cyclodextrin in aqueous solution. The interactions are relatively weak compared with other guest molecules. Phase solubility analysis was used to investigate several effects (pH, temperature) on complexation in solution. The thermodynamic parameters for the complexation were derived from linear van’t Hoff plots which indicate the presence of the enthalpy-entropy-compensation phenomenon. The complex stoichiometry was derived amongst others from Job’s plots employing 1H-NMR-spectroscopy. For most sulfa drugs complexation not only results in a solubility enhancement of the guest, but also increases the low intrinsic solubility of β-cyclodextrin itself. This effect was quantified at several pH values. It is of comparable extent for all guest molecules with exception of sulfathiazole. Making use of the described phenomenon one can achieve β-cyclodextrin concentrations many times higher than its intrinsic solubility in solution. The structure of the inclusion complexes was examined in solution and in the solid state using the means of spectroscopy. ROESY spectra of some model substances show that the chemically related molecules occupy considerably different positions and orientations inside the cyclodextrin’s cavity. FTIR spectra of solid complex formulations support the more detailed NMR-results in most cases. In addition, theoretical structures for the inclusion complexes were created by molecular mechanics. Cyclodextrin flexibility and a possible ‘induced-fit’ were simulated by generating multiple conformations of β-cyclodextrin by molecular dynamics. Docking experiments were carried out in order to characterize the inclusion mode of the sulfonamides. Under the experimental conditions we observed those orientations to be predominant where the aromatic amino group and the oxygen atoms of the sulfonamide are able to establish H-bonds to the host’s hydroxyl groups. The resulting disturbance of the intermolecular and intramolecular H-bonds of β-cyclodextrin is one possible explanation for the synergistic solubility effects between host and guest. The data obtained forms a foundation for the characterization of the complexation process of sulfonamides and natural cyclodextrins. All model substances were investigated applying the same methods allowing a comparative interpretation. Overall, studying a larger group of model substances of similar chemical properties und molecular structure showed the variations of the inclusion process even in such a homogenous group of guests. The results of this thesis make it obvious that predictions concerning complex formation with cyclodextrins are not possible by considering investigations of related model substances. Instead, complex formation should always be regarded as an individual case.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen natürlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die stärksten Wechselwirkungen in wässriger Lösung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in größerem Umfang Komplexe. Für die Mehrzahl der Gastmoleküle werden Isothermen vom Bs-Typ, für Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute Löslichkeit der Komplexe kann eine deutliche Löslichkeitssteigerung für diese beiden Gastmoleküle in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist für alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, für Flurbiprofen beträgt sie etwa 14000 M-1 und für Ibuprofen sogar über 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmoleküle eine entscheidende Größe für das Ausmaß der Komplexbildung darstellen könnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erhöhter Dissoziationsgrad der Gastmoleküle durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten führten. Löslichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. Für Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van’t Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten für Ibuprofen ergänzende Werte für die Assoziationskonstante und die Gibbs’sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung für diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job’s Plots deuten auf eine Stöchiometrie von 1:1 für Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass für die anderen Moleküle dieselbe Stöchiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe höherer Ordnung möglich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit’s des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen über die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolekülanteil zu bestimmen. In lyophilisierten Lösungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavität lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien bestätigt, die Einblick in die Komplexstruktur im wässrigen Medium gewährten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavität ein. Möglicherweise liefern diese einen Erklärungsansatz für das besondere Verhalten der Gastmoleküle Naproxen und Fenbufen in den Löslichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine Störung der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen des Cyclodextrins möglich wird, was für die erhöhte Löslichkeit des Wirtes verantwortlich sein könnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmoleküls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmoleküle scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Ausprägung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, können Vorhersagen für ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschränkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten. / In this thesis various analytical methods were applied to characterise the interactions between natural cyclodextrins and the nonsteroidal anti-inflammatory drugs ibuprofen, ketoprofen, naproxen, flurbiprofen, felbinac, and fenbufen. The results were analyzed in order to find out, if predictions for the extent of the association and structure of the formed complexes can be deduced from the basic structure or the functional groups of the guest. Solubility determination showed that all model substances – particularly the biphenyl derivatives – are of extreme low solubility in water. First of all, complex formation of the three natural cyclodextrins and the model substances in aqueous solution was investigated. All guests preferably form complexes with β-cyclodextrin. Only flurbiprofen gains a notable solubility enhancement by addition of γ-cyclodextrin. For the majority of the model substances a BS-isotherm is obtained while fenbufen and naproxen exhibit A-type isotherms. From this, a distinct solubility enhancement can be achieved for the latter guests in solution. For the whole group complex formation is a spontaneous process. Their association constants at 25°C range from 1000 to 5000 M-1, for flurbiprofen up to 14000 M-1 and for ibuprofen even over 40000 M-1. A correlation of drug partition coefficient and association constants seems to imply that guest polarity could be an important factor for the extent of the inclusion process. Complex formation was investigated at several pH values. Increasing pH values and thus a higher degree of acid dissociation consequently led to decreasing complexation constants. Phase-solubility analysis at different temperatures showed unexpectedly no uniform tendency in the association constants. For naproxen and ketoprofen linear Van’t Hoff plots could be obtained. In addition, calorimetric studies provided thermodynamic data comparable to phase-solubility analysis for ibuprofen. From there complex formation with these guests is driven both by enthalpy and entropy. Job’s plots by NMR spectroscopy indicate a 1:1 complex stoichiometry for ibuprofen, flurbiprofen and felbinac. Although the same composition can be found for the other molecules in literature the formation of higher order complexes seems to be possible. Docking studies were applied to develop a molecular modeling procedure for the prediction of complex formation. Plausible molecular arrangements were derived indicating an induced fit of the cyclodextrin and possibly intermolecular hydrogen bonding. Several techniques were applied to obtain solid complex preparations in order to gather additional information about the formed complexes in the solid state. Thermal analysis was used for the determination of the inclusion yield. The lowest fraction of free guest was observed in freeze dried solutions. For fenbufen and naproxen the determination was not successful probably caused by changes in cristallinity. FT-IR spectra of the solid complex preparations and physical mixtures indicated the inclusion of the guest’s aromatic part and carbonyl group into the cavity except for felbinac. In most cases these findings are supported by twodimensional NMR-spectra. Here the guest molecules occupy variable orientations inside the cyclodextrin cavity. From the results one can deduce possible explanations for the unusual form of the phase solubility isotherms of naproxen and fenbufen. The carboxylic acid group is positioned possibly allowing a disturbance of the cyclodextrins intramolecular hydrogen binding system and thus causing an increased solubility of the host. To summarize, the basic structure and functional groups of the guest molecule are of particular importance for the structure and the properties of the complexes formed with cyclodextrins and for the extent of the host guest interactions. Possibly the lipophilicity of the guest molecules can be applied for a vague estimation of attraction. As complex formation is driven by a diversity of different factors predictions for a system are only possible under certain limitations. Complex formation should always be regarded as a single case. A general decision for or against the application of cyclodextrins is not feasible.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Techn. Universiẗat, Diss., 2000--Berlin.

Universiẗat, Diss., 2004--Bonn.

For the assessment of metabonomics techniques for the early, non-invasive detection of toxicity, the nephrotoxins gentamicin (s.c. administration of 0, 60 and 120 mg/kg bw 2x daily for 8 days), ochratoxin A (p.o. administration of 0, 21, 70 and 210 µg/kg bw 5 days/week for 90 days) and aristolochic acid (p.o. administration of 0, 0.1, 1.0 and 10 mg/kg bw for 12 days) were administered to rats and urine samples were analyzed with 1H-NMR and GC/MS. Urine samples from the InnoMed PredTox project were analyzed as well, thereby focusing on 1H-NMR analysis and bile duct necrosis as histopathological endpoint. 1H-NMR analysis used water supression with the following protocol: 1 M phosphate buffer, D2O as shift lock reagent, D4-trimethylsilyl­propionic acid as chemical shift reference, noesygppr1d pulse sequence (Bruker). For multivariate data analysis, spectral intensity was binned into 0.04 ppm wide bins. GC/MS analysis of urine was carried out after protein precipitation with methanol, drying, derivatization with methoxyamine hydrochloride in pyridine and with methyl(trimethylsilyl)­trifluoroacetamide on a DB5-MS column using EI ionization. The chromatograms were prepared for multivariate data analysis using the R-program based peak picking and alignment software XCMS version 2.4.0. Principal component analysis (PCA) to detect and visualize time-point and dose-dependent differences between treated animals and controls and orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) for identification of potential molecular markers of toxicity was carried out using SIMCA P+ 11.5 1H-NMR-based markers were identified and quantified with the Chenomx NMR Suite, GC/MS based markers were identified using the NIST Mass Spectral Database and by co-elution with authentic reference standards. PCA of urinary metabolite profiles was able to differentiate treated animals from controls at the same time as histopathology. An advantage over classical clinical chemistry parameters regarding sensitivity could be observed in some cases. Metabonomic analysis with GC/MS and 1H-NMR revealed alterations in the urinary profile of treated animals 1 day after start of treatment with gentamicin, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate, trigonelline and 3-indoxylsulfate increased excretion of 5-oxoproline, lactate, alanine and glucose were observed. Ochratoxin A treatment caused decreased excretion of citrate, 2-oxoglutarate and hippurate and and increased excretion of glucose, myo-inositol, N,N-dimethylglycine, glycine, alanine and lactate as early as 2 weeks after start of treatment with 210µg OTA/kg bw, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Integration of histopathology scores increased confidence in the molecular markers discovered. Aristolochic acid treatment resulted in decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate and creatinine as well as increased excretion of 5-oxoproline, N,N-dimethylglycine, pseudouridine and uric acid. No alterations in clinical chemistry parameters or histopathology were noted.Decreased excretion of hippurate indicates alterations in the gut microflora, an effect that is expected as pharmacological action of the aminoglycoside antibiotic gentamicin and that can also be explained by the p.o. administration of xenobiotica. Decreased Krebs cycle intermediates (citrate and 2-oxoglutarate) and increased lactate is associated with altered energy metabolism. Increased pseudouridine excretion is associated with cell proliferation and was observed with aristolochic acid and ochratoxin A, for which proliferative processes were observed with histopathology. 5-oxoproline and N,N-dimethylglycine can be associated with oxidative stress. Glucose, a marker of renal damage in clinical chemistry, was observed for all three nephrotoxins studied. Single study analysis with PCA of GC/MS chromatograms and 1H-NMR spectra of urine from 3 studies conducted within the InnoMed PredTox project showing bile duct necrosis revealed alterations in urinary profiles with the onset of changes in clinical chemistry and histopathology. Alterations were mainly decreased Krebs cycle intermediates and changes in the aromatic gut flora metabolites, an effect that may result as a secondary effect from altered bile flow. In conclusion, metabonomics techniques are able to detect toxic lesions at the same time as histopathology and clinical chemistry. The metabolites found to be altered are common to most toxicities and are not organ-specific. A mechanistic link to the observed toxicity has to be established in order to avoid confounders such as body weight loss, pharmacological effects etc. For pattern recognition purposes, large databases are necessary. / Zur Bewertung von Metabonomics-Techniken zur frühen, nicht-invasiven Erkennung von Toxizität wurde Rattenurin nach wiederholter Gabe von Nephrotoxinen mit 1H-NMR und GC/MS analysiert. Untersucht wurden Gentamicin (s.c.-Gabe von 0, 60 und 120 mg/kg Körpergewicht (KG) 2x tägl. über 8 Tage), Ochratoxin A (p.o.-Gabe von 0, 21, 70 und 210 µg/kg KG 5xl wöchentlich für 90 Tage) und Aristolochiasäure (p.o.-Gabe von 0, 0.1, 1.0 und 10 mg/kg KG über 12 Tage). Proben von 16 Studien des InnoMed PredTox Projekts wurden mit 1H-NMR auf den histopathologischen Endpunkt Gallengangnekrose (BDN) untersucht. Folgende Parameter wurden zur 1H-NMR-Analyse mit Wasserunterdrückung verwendet: 1 M Phosphatpuffer, shift lock Reagenz D2O und Referenzierung der chemischen Verschiebung auf D4-Trimethylsilyl­propionsäure, noesygppr1d-Pulssequenz (Bruker). Zur multivariaten Datenanalyse wurden die Spektren in 0.04 ppm große „bins“ unterteilt. Zur GC/MS-Analyse wurden nach Proteinfällung mit Methanol die Urinproben getrocknet und mit Methoxyaminhydrochlorid in Pyridin und Methyl(trimethylsilyl)trifluoracetamid derivatisiert und auf einer DB5-MS -Säule getrennt. Die GC/MS-Chromatogramme wurden mit dem R-Programm-basierten XCMS-Softwarepaket Version 2.4.0 zur multivariaten Datenanalyse vorbereitet. Hauptkomponentenanalyse (PCA) zur Visualisierung von zeit- und dosisabhängigen Unterschieden zwischen Kontrollen und behandelten Tieren und „orthogonal projection to latent structures“-Diskriminantenanalyse (OPLS-DA) zur Identifizierung von Toxizitätsmarkern erfolgte mit SIMCA P+11.5 Die Chenomx-NMR-Suite wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von 1H NMR-basierten Markern verwendet; GC/MS-basierte Marker wurden mit der „NIST Mass Spectral Database“ und durch Koelution mit Referenzstandards identifiziert. PCA unterschied Kontroll- von behandelten Tieren zum gleichen Zeitpunkt wie Histopathologie. Gegenüber klinisch-chemischen Parametern war Metabonomics in einigen Fällen empfindlicher. Gentamicin induzierte nach Tag 1 erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat, Hippurat, Trigonellin und 3-Indoxylsulfat Urin, sowie erhöhte Ausscheidung von Lactat, Alanin, 5-Oxoprolin und Glucose, begleitet von geringfügigen Änderungen in klinisch-chemischen Parametern. Ochratoxin A verursachte nach zwei Wochen in einzelnen Tieren eine erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat und Hippurat sowie eine erhöhte Ausscheidung von Glucose, myo-Inositol, N,N-Dimethylglycin, 5-Oxoprolin, Glycin, Alanin und Lactat, korrelierend mit Veränderungen in klinisch-chemischen Parametern und in der Histopathologie. Verwendung von Histopathologiedaten in multivariaten Modellen zur Markeridentifizierung erhöhte die Konfidenz der Marker. Aristolochiasäure induzierte eine erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat, Hippurat und Creatinin und eine erhöhte Ausscheidung von 5-Oxoprolin, N,N-Dimethylglycin und Pseudouridin, ohne Veränderung der klinisch-chemischen Parameter oder der Histopathologie. Erniedrigte Ausscheidung von Hippurat weist auf eine veränderte Darmmikroflora hin; für das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin ist dies ein pharmakologischer Effekt, der für die perorale Gabe von Xenobiotica zu erwarten ist. Erniedrigte Ausscheidung von Citrat und 2-Oxoglutarat und erhöhte Ausscheidung von Lactat zeigt einen veränderten Energiestoffwechsel. Erhöhte Ausscheidung von Pseudouridin ist mit Zell­proliferation assoziiert und wurde nach Gabe der Kanzerogene Ochratoxin A und Aristolochiasäure beobachtet, bei denen proliferative Prozesse in der Histopathologie gefunden wurden. 5-Oxoprolin und N,N-Dimethyl­glycin deuten auf erhöhten oxidativen Stress hin. Erhöhte Glucose im Urin, ein Parameter zur Diagnose von Nierenschäden in der klinischen Chemie, wurde in allen drei Studien mit Nephrotoxinen beobachtet. GC/MS- und 1H-NMR-Daten von InnoMed-Studien mit Gallengang­nekrosen als histopathologischen Endpunkt zeigten Veränderung im Urin zeitgleich mit klinisch-chemischen Parametern und Histopathologie; hauptsächlich erniedrigte Ausscheidung von Citratzyklusintermediaten und Veränderungen bei Darmflora-assoziierten Metaboliten, – ein Effekt, der wahrscheinlich veränderten Gallenfluss zurückzuführen ist. Metabonomics ist prinzipiell zum gleichen Zeitpunkt wie klinisch-chemische Parameter und Histopathologie zur Erkennung von toxischen Veränderungen geeignet. Die veränderten Metaboliten sind jedoch zumeist nicht organspezifisch und können mit allgemeinen Toxizitätsmechanismen, wie oxidativem Stress oder Zellproliferation, in Verbindung gebracht werden. Für die Bewertung der Ergebnisse von Metabonomics-Studien ist ein mechanistisches Verständnis der Veränderungen im Urinprofil notwendig, um eine Trennung von toxischen Effekten und solchen, die auf pharmakologische Wirkung, Körpergewichtsverlust etc. zurückzuführen sind, zu erreichen. Für eine Vorhersage von toxischen Mechanismen aufgrund der Urinprofile ist eine größere Datengrundlage notwendig.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Fragestellung, ob sich die quantitative NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen eignet, und wie sich Präzision und Empfindlichkeit dieser Methode im Vergleich zu etablierten chromatographischen Verfahren verhalten. Die quantitative Untersuchung der drei strukturell jeweils verwandten Mehrkomponentengemische Codergocrinmesilat, Clomifencitrat und Flupentixoldihydrochlorid bewies eindrucksvoll die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie als orthogonale, analytische Messmethode im Vergleich zu validierten HPLC-Arzneibuchmethoden. Die im Rahmen einer Validierung der 1H-NMR-Methode ermittelten Ergebnisse erfüllten bezüglich Präzision und Richtigkeit die an eine im pharmazeutischen Bereich eingesetzte analytische Methode gestellten Anforderungen; zudem wurden weitere Prüfparameter wie Selektivität, Linearität, Robustheit und Stabilität verifiziert. Externe-Standard-Experimente wie "Zwei-Röhrchen-Methode" und ERETIC-Verfahren bestätigten die quantitativen Ergebnisse der Internen Standardisierung; jedoch wurde hier -- insbesondere für die ERETIC-Technik -- eine höhere Fehleranfälligkeit und somit eine größere Streuung der Einzelergebnisse beobachtet. Am Beispiel von Codergocrinmesilat und Flupentixoldihydrochlorid konnte zudem die Eignung anderer NMR-aktiver Kerne wie 13C und 19F für die quantitative Analyse von komplexen Substanzgemischen aufgezeigt werden. Das Potential der 1H-NMR-Spektroskopie für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen wurde am Beispiel der Aminosäure L-Alanin aufgezeigt. Die zu erwartenden Verunreinigungen Glutamin-, Asparagin-, Äpfel- und Fumarsäure konnten im Gegensatz zu den "veralteten" Prüfmethoden des Europäischen Arzneibuches eindeutig identifiziert und quantifiziert werden; mit einer Bestimmungsgrenze von <= 0.03% wurden die Vorgaben der ICH-Richtlinie Q3A(R2) erfüllt. Die deutliche Übereinstimmung der NMR-spektroskopisch ermittelten Ergebnisse einer quantitativ untersuchten Alanin-Modellmischung mit einer für den Routinebetrieb geeigneten HPLC-Methode unter Einsatz verschiedener Detektoren wie CAD, NQAD, ELSD und MS, sowie der Vergleich wichtiger Prüfparameter wie Linearität und Nachweisgrenze bestätigten die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Qualitätskontrolle. Die Aufdeckung von Arzneimittelfälschungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der zwei aktuellen Fallbeispiele Heparin und Glycerin näher untersucht. Die in Zusammenhang mit dem Heparin-Skandal verantwortliche Kontaminante OSCS konnte neben Dermatansulfat und weiteren natürlich vorkommenden Glykosaminoglykan-Verunreinigungen im 1H-NMR-Spektrum eindeutig identifiziert und auf 0.1% OSCS bzw. 0.5% Dermatansulfat begrenzt werden. Eine präzise und richtige quantitative Bestimmung der beiden Glykosaminoglykane wurde über die N-Acetyl-Resonanzen mit Hilfe der Signalhöhenbestimmung und dem Standard-Additionsverfahren ermöglicht; deutliche Abweichungen vom "wahren" Gehalt wurden hingegen, bedingt durch starke Signalüberlagerungen, nach Flächenvergleich beobachtet. Weitere Verunreinigungen, insbesondere Lösungsmittelrückstände, die während des Extraktions- und Reinigungsprozesses des Heparins eingesetzt werden, konnten ebenfalls über charakteristische Resonanzen identifiziert und mit Hilfe der Internen-Standard-Methode quantitativ erfasst werden. Eine umfangreiche Untersuchung von 145 Heparin-API-Mustern mittels NMR-Spektroskopie und weiteren, neuentwickelten Verfahren wie HPLC, CE, IR- und Raman-Spektroskopie konnte die Eignung der entwickelten 1H-NMR-Methode bestätigen. Potentielle Glycerin-Kontaminanten wie Diethylenglycol und Ethylenglycol konnten ebenso wie eine weitere, natürlich vorkommende Verunreinigung, Propylenglycol, mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Beide Methoden erfüllten die in der USP beschriebenen Anforderungen, die für pharmazeutisch eingesetztes Glycerin jeweils höchstens 0.1% Diethylenglycol bzw. Ethylenglycol erlaubt. Während die quantitative Reinheitsprüfung beim Einsatz der 1H-NMR-Spektroskopie mit einer Messdauer im Bereich von etwa 30 min für den Routineeinsatz geeignet ist, ist die entwickelte quantitative 13C-NMR-Methode beim Einsatz von Spektrometern geringer Magnetfeldstärke aufgrund einer geringen Nachweisempfindlichkeit und der NOE-Problematik für den Routinebetrieb nur bedingt anwendbar. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die untersuchten Beispiele die NMR-Spektroskopie als in hohem Maße geeignet für die quantitative Analyse von Arzneimitteln ausweisen. / The main objective of the present thesis was the investigation of the suitability of quantitative NMR spectroscopy for identification, purity assay, and quantification of a given drug, as well as a comparison of precision and sensitivity of this method with well-established chromatographic routines. The quantitative analysis of the three multi-component drug mixtures codergocrine mesylate, clomiphene citrate, and flupentixol dihydrochloride strikingly demonstrates the suitability of the 1H NMR spectroscopy as an independent analytical measurement technique in comparison to validated HPLC methods of international pharmacopoeias. Concerning precision and accuracy, the results obtained from validation of the 1H NMR method met the requirements that are made on an analytical routine for pharmaceutical purposes; additionally, further validation parameters such as selectivity, linearity, robustness, and stability have been verified. Experiments like the "twin tube" and ERETIC techniques utilizing external standards confirm these results; however, in this context an increased error rate and therefore larger variance was observed, especially in the case of ERETIC. By means of codergocrine mesylate and flupentixol dihydrochloride, additionally the suitability of other NMR active nuclei as 13C or 19F for quantification of complex mixtures was shown. The potential of the 1H NMR spectroscopy for purity assays was demonstrated for the example of the amino acid L-alanin. Identification and quantification of the expected impurities glutamic acid, aspartic acid, malic acid, and fumaric acid was possible, in contrast to "out-dated" test methods of the European Pharmacopoeia; achieving a limit of quantification <= 0.03%, the demands of the ICH guideline Q3A(R2) have been met. Concerning the quantification of an alanine model mixture, the clear agreement between the results obtained by means of NMR spectroscopy and a HPLC method using various detectors like CAD, NQAD, ELSD, and MS, suited for routine analysis, as well as the comparison of various relevant parameters such as linearity and limit of quantification confirmed the qualification of 1H NMR spectroscopy in the field of routine quality assurance. Within the scope of this work, the disclosure of counterfeit drugs by means of NMR spectroscopy was investigated in detail utilizing two current case studies, namely heparin and glycerin. Besides dermatan sulfate and other natural occurrences of glycosaminoglycan impurities, the contaminant OSCS revealed in connection with the recent heparin affair was clearly identified in the 1H NMR spectrum and these contaminants could be limited to 0.1% OSCS and 0.5% dermatan sulfate, respectively. A precise and accurate quantification of these two glycosaminoglycanes was achieved using signal height and standard addition methods applied to the N-acetyl resonances; comparison of signal areas however yielded considerable deviations from the "true" content, which are due to strong signal overlap. Further contaminants, especially solvent residues originating from the extraction and purification processes of heparin, have been able to be identified with the help of characteristic resonances; their quantification was possible. An extensive study of 145 heparin API samples by means of NMR spectroscopy and other novel techniques such as HPLC, capillary electrophoresis, IR and Raman spectroscopy confirmed the qualification of the developed 1H NMR method. Potential contaminants in glycerin such as diethylene glycol and ethylene glycol have been able to be identified as well as quantified by means of 1H and 13C NMR spectroscopy, as was the case for propylene glycol, which is naturally present. Both methods met the requirements of the USP, limiting the amount of diethylene glycol and ethylene glycol for pharmaceutical purposes to 0.1%, respectively. While 1H NMR spectroscopy with a measurement time of about 30 min is well suited for routine application, the applicability of the 13C NMR method is limited due to the NOE effect and the low sensitivity at low field strengths. In conclusion, each of the attended topics showed, that NMR spectroscopy is a powerful tool within the framework of quantitative drug analysis.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 1999--Bochum.