Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram négatif possédant un métabolisme très versatile lui permattant de proliférer dans plusieurs types environnements. Sa capacité à produire plusieurs facteurs de virulence lui permet de causer des infections opportunistes tel que des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique. Notre équipe a développé la mutagénèse à étiquette, basée sur la PCR (PCR based Siggnature-tagged mutagenesis), permettant de cribler une banque de 7968 mutants. Cette technique a permis la sélection de 214 mutants représentant des évènements d’insertion d’un mini-transposon dans 148 gènes différents. De ces nouveaux gènes essentiels à l’infection par P. aeruginosa, nous avons choisi de caractériser le gène PA3498. Nous avons conclu que la protéine codée par ce gène est nécessaire à l’initiation et/ou au maintien du pathogène in vivo ainsi qu’à la maturation des protéases sécrétées par P. aeruginosa et qu’elle est homologue à l’oxydoréductase PDR de Burkholderia cepacia. / Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacteria causing chronic pulmonary infections in cystic fibrosis patients. Virulence factors of this pathogen facilitate the colonization of the pulmonary tract and lungs of cystic fibrosis patients. Our team has developed a PCR-based signature-tagged mutagenesis technique permitting the screening of a collection of 7968 mutants. A total of 214 mutants, representing transposition events into 148 open reading frames, were shown to be attenuated in lung infection and were retained for further analysis. Of these genes, we chose PA3498 for its characterization. We have concluded that this gene is coding for an oxydoreductase sharing homology with a familly of oxydoreductases including PDR protein of Burkholderia cepacia. Finally, PA3498 protein is needed to initiate or/and to maintain the pathogen in vivo and this protein plays a role in the maturation and processing of the P. aeruginosa exoproteases.

Pseudomonas aeruginosa souche LESB58 est une bactérie pathogène connue pour sa versatilité, son antibiorésistance et son caractère opportuniste émergent qui le rend responsable d'infections nosocomiales importantes en milieu hospitalier. Dans le cadre de ce travail, nous posons l’hypothèse qu’il est possible d’étudier le génome de la bactérie pathogène P. aeruginosa souche LESB58 par une approche de modélisation métabolique et analyse in silico à partir des annotations de son génome séquencé. Nous utilisons une approche basée sur les contraintes nommée « Fc (FBA) » pour analyser le modèle in silico. Comme le génome de P. aeruginosa n’est pas très caractérisé et qu’il contient un nombre considérable de gènes sans annotation fonctionnelle, nous n’avons pas terminé la reconstruction à l’échelle génomique. Comme un nombre important de relations « génotype-phénotype » n’ont pu être établies, nous avons débuté une analyse de génomique comparative de quatre souches séquencées de P. aeruginosa, soit les souches LESB58, PAO1, PA7 et PA14, afin de cibler les gènes impliqués dans les phénotypes connus de P. aeruginosa. Le but de ce travail a été de s’initier aux méthodes d’analyses métaboliques in silico et de recherches de relations « génotype-phénotype » pouvant reconstruire un modèle in silico.

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène opportuniste ubiquitaire. Les souches LES (Liverpool Epidemic Strain), associées à des infections pulmonaires chroniques, ont initialement été isolées en 1988 des expectorations de patients souffrant de fibrose kystique. Leurs nombreux facteurs de virulence, comme l'importante production de biofilm, rendent ces bactéries particulièrement difficiles à éradiquer. Des mutants de la souche LESB58, une souche LES, ont été obtenus grâce à la mutagenèse par étiquette. Trois mutants sélectionnés suite à leur avirulence chez le rat, l'amibe et la drosophile ont été obtenus: L70T18G, L138T21T et L155T7T. L'objectif de cette maîtrise est d'établir un lien entre la perte de virulence et les gènes mutés via l'analyse phénotypique des mutants. Une caractérisation des mutants a été réalisée par analyse du biofilm en microfluidique, des tests de détection des lipases, de pigmentation et de prédation en utilisant l'amibe. L'effet de l'ion magnésium (Mg²⁺) sur certains facteurs de virulence a également été mesuré. En microfluidique, la morphologie générale du biofilm attaché varie peu d'une souche à l'autre. L155T7T ne semble pas être capable de produire du biofilm en condition de microfluidique tandis que L138T21T s'établit plus rapidement que la souche sauvage. Un défaut de pigmentation chez la souche L138T21T est observable sur les différents milieux utilisés. Les mutants ne semblent pas présenter de défaut au niveau de leur sécrétion de lipases. De plus, suite à l'ajout de l'ion Mg²⁺, L70T18G, voit sa résistance à la prédation amibienne augmenter tandis que la souche sauvage perd de sa résistance. Chaque mutant présente un profil phénotypique distinct qui suggère que la virulence de la souche LESB58 est une combinaison de différents facteurs. Pour compléter la caractérisation et mieux jauger l'importance relative des différents facteurs de virulence, il serait intéressant d'effectuer d'autres tests comme l'ajout d'ions en microfluidique. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous opportunistic pathogen. The LES (Liverpool Epidemic Strain) strains, associated with chronic pulmonary infections, were initially isolated in 1988 from the sputum of patients suffering from cystic fibrosis. Their many virulence factors, such as the high production of biofilm, make these bacteria particularly difficult to eradicate. Mutants of the LESB58 strain, a LES strain, were obtained by signature-tagged mutagenesis. Three mutants selected for their avirulence in rats, amoeba and drosophila were obtained: L70T18G, L138T21T and L155T7T. In order to establish a link between these genes and the loss of virulence of the corresponding mutants, a phenotypic analysis of the mutants constitutes the objective of this project. Characterization of the mutants was performed by microfluidic biofilm analysis as well as lipase detection, pigmentation and amoeba-based predation tests. The effect of the magnesium ion (Mg²⁺) on some virulence factors was also measured. In microfluidics, the general morphology of the attached biofilm slightly varies from one strain to another. L155T7T does not appear to be able to produce biofilm under microfluidic conditions while L138T21T establishes a biofilm faster than the wild strain inside the channels. A pigmentation defect in the L138T21T strain is observable on the various media used. The mutants do not seem to present any defect in their secretion of lipases. Moreover, following the addition of the Mg²⁺ ion, L70T18G sees its resistance to predation by amoebae increased while the wild strain loses resistance. Each mutant exhibits a distinct phenotypic profile which suggests that the virulence of strain LESB58 is a combination of different factors. To complete the characterization and better gauge the relative importance of the different virulence factors, it would be interesting to perform othertests such as the addition of ions in microfluidics.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste pouvant causer des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de la Fibrose Kystique (FK). Pour réussir à s’implanter dans les voies respiratoires des patients FK, P. aeruginosa dispose d’un important arsenal de facteurs de virulence, dont la sécrétion de protéases, de lipases, de phospholipases ainsi que la production de toxines spécifiques. Le séquençage complet du chromosome de P. aeruginosa souche PAO1 (6.3 Mb) a révélé une organisation génomique hautement régulée. Dans le but de mieux comprendre l’interaction hôte-pathogène, nous avons utilisé la technique de mutagenèse à étiquette (STM). La STM a permis d’isoler 214 mutants incapables de maintenir l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Parmi ceux-ci, le mutant STM2895, contenant un transposon dans le gène PA2895, a été retenu pour des analyses plus approfondies. L'étude phénotypique de STM2895 a permis de constater un défaut dans la production d’exoprotéases lorsque comparé à la souche sauvage PAO1. La caractérisation biochimique de ce défaut, utilisant des tests de dégradation spécifiques et l’immunobuvardage, a démontré qu’au moins deux des quatre protéases majeures sécrétées par P. aeruginosa sont impliquées. En effet, les élastases LasA et LasB ont été démontrées non fonctionnelles probablement dues à un problème de repliement. PA2895, une protéine possédant un domaine transmembranaire prédit, ne code pour aucune fonction connue, mais il est co-transcrit avec le gène PA2896, un facteur sigma putatif de type ECF (extracytoplasmic function). Des analyses en transcriptome sur le mutant STM2895, ainsi que sur un mutant de délétion de PA2896, ont permis de lier l’opéron au métabolisme du fer. De plus, des études in vivo dans le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat ont clairement démontré que le mutant STM2895 est incapable de se maintenir dans l’hôte au même niveau que la souche sauvage PAO1. Le gène PA2895 est donc essentiel au maintien in vivo de P. aeruginosa dans le poumon de rat. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause pulmonary infections in cystic fibrosis patients (CF). To overcome innate self defense, P. aeruginosa possesses a wide arsenal of virulence factors. These include degradation enzymes such as proteases, lipases and phospholipases and the production of three specific toxins: exotoxin A and exoenzymes S and T. Sequencing of the complete P. aeruginosa chromosome (strain PAO1) of 6.3 Mb revealed a highly regulated and complex genomic organization. In order to better understand host-pathogen molecular interactions, we developped a new signature-tagged mutagenesis (STM) approach based on PCR screening. The PCR-based STM technology lead to the identification of 214 mutants deficient in their ability to maintain a chronic pulmonary infection in the rat lung. In that pool of STM mutants, STM2895, which contains a transposon insertion in functional PA2895, was the most frequently drafted during the whole mutant library screening. Phenotypic analyses of the STM2895 strain allowed us to identify an exoprotease production defect as compared with wild type strain PAO1. The biochemical characterization of that proteolytic default using specific degradation assays combined with western blotting revealed that at least two (LasA and LasB) of the four major exoproteases from P. aeruginosa STM2895 strain are inactive. In fact, LasA and LasB elastases were shown to be present in the STM2895 culture supernatant, correctly processed but inactive due to a probable misfolding of proteins. The PA2895 gene (unknown function) encodes a protein with a predicted transmembrane domain. Basic genomic context analyses strongly suggest a cotranscription unit with the downstream gene PA2896, a putative sigma 70 factor from ECF (extracytoplasmic function) type. Microarray experiments on the STM2895 strain and an insertional mutant of the PA2896 gene were performed to establish a link between the putative PA2895-PA2896 operon and the metabolism of iron. Transcriptome analysis also demonstrated a repressive action of PA2895 on the transcription of PA2896 putative sigma factor. Finally, in vivo studies in the rat lung chronic infection model clearly showed a ten-fold decrease in survival capacity of the mutant strain when compared to the PAO1 wild-type strain.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste, hautement résistant à une multitude d’antibiotiques qui infecte principalement les patients immunosupprimés. Il représente la cause principale de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (mucoviscidose). Le but principal de ce projet consistait à identifier et à caractériser des gènes essentiels à l’infection et au maintien de P. aeruginosa dans un modèle animal d’infection pulmonaire chronique. À partir d’une banque de mutants transpositionnels, nous avons identifié 148 mutants de P. aeruginosa déficients à causer l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Suite à des analyses bioinformatiques, le mutant inactivant le gène PA5437 a été sélectionné. L’opéron adjacent code pour les sous unités du pyruvate carboxylase (pycA et pycB) et est régulé par le gène PA5437, d’où l’appellation pycR pour pyruvate carboxylase regulator. Le pycR a été identifié comme étant un régulateur transcriptionnel de type LysR ayant une région typique de liaison à l’ADN. Le codon d’initiation de la transcription des gènes pycR et pycA a été identifié par élongation d’amorce. La capacité de liaison de la protéine PycR à l’ADN a été confirmée à l’aide du gel à retardement. L’implication de PycR dans la virulence bactérienne in vivo a été confirmée par indice de compétition et après 7 jours d’infection le mutant déficient ΔpycR est complètement éliminé du poumon du rat. L’importance de PycR a aussi été confirmée in vitro à l’aide des tests phénotypiques et enzymatiques démontrant la déficience dans la production de la lipase, de l’estérase et du biofilm. Finalement, l’analyse des résultats métaboliques et transcriptomiques a confirmé l’importance de PycR dans la régulation du métabolisme de lipides, de l’activité lipolytique, de la respiration anaérobique, de la formation du biofilm et des gènes régulés par le quorum sensing. Dans un second volet, une étude comparative entre souches prototypes (PAO1 et PA14) de P. aeruginosa et un isolat clinique (LESB58) de la fibrose kystique a été réalisée dans un modèle de l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Cette étude a permis d’identifier des différences significatives au niveau de la localisation bactérienne dans les tissus pulmonaires de l’isolat clinique LESB58. D’importantes différences ont également été notées au niveau des facteurs de virulence comme la mobilité et la formation du biofilm. À long terme, les nouvelles connaissances acquises en génomique fonctionnelle devraient permettre d’identifier et de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de combattre et mieux comprendre les infections causées par cette bactérie. / The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is highly resistant to most classes of antibiotics and causes a wide variety of infections in compromised hosts. In addition, it represents the major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. The principal goal of the present research project was to identify and to characterise P. aeruginosa genes essential for causing a chronic lung infection. Using a PCR-based signature-tagged mutagenesis, we identified a P. aeruginosa STM5437 mutant having an insertion into the PA5437 gene; its inactivation causes attenuation of virulence in vivo. The PA5437 gene, now called pycR, regulates the adjacent operon encoding the pyruvate carboxylase subunits (pyruvate carboxylase regulator). PycR has the signature of a putative transcriptional regulator with a predicted helix-turn-helix motif binding to a typical LysR DNA-binding motif identified in the PA5436 (pycA)-PA5437 (pycA) intercistronic region. Transcriptional start sites of pycA and pycR were identified by primer extension and the DNA binding capacity of PycR was confirmed by a DNA mobility gel shift assay. Genome-wide transcriptional profiling indicated that the genes whose control were differentially expressed by PycR implicated genes responsible for lipid metabolism, lipolytic activity, anaerobic respiration, biofilm formation and a number of quorum sensing regulated genes. This study defines PycR as a major regulator in virulence and where mutations in pycR have pleiotropic effects on the expression of multiple virulence factors such as lipase, esterase and biofilm formation. The expressions of several of these genes are associated with chronic lung persistence. In the second part of the study, P. aeruginosa prototype strains PAO1 and PA14 were compared with the CF isolate LESB58 in the rat model of chronic lung infection. This comparative study identified major differences for LESB58; in vivo in bacterial localisation in the rat lung and in vitro for motility and biofilm production. Functional genomics of P. aeruginosa will provide new insights for the development of novel therapeutic targets. Genomic biodiversity may explain the variation in severity of the P. aeruginosa infections in CF disease.