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O Hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) congênito é uma síndrome clínica rara causada por defeito na produção ou secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelo hipotálamo ou por resistência hipofisária à ação do GnRH. O HHI é mais prevalente em homens e cerca de 50% a 60% dos indivíduos afetados apresentam anosmia ou hiposmia associada, caracterizando a síndrome de Kallmann. Diversos genes já foram associados à patogênese do HHI congênito, porém, a maioria dos casos ainda permanece sem diagnóstico molecular definido. Até recentemente, a identificação das causas genéticas dos pacientes com HHI era realizada por sequenciamento de genes candidatos, empregando a técnica de Sanger. No entanto, com o número crescente de genes descritos nos últimos anos, esse processo vem se tornando impraticável. Novas metodologias de sequenciamento (sequenciamento paralelo em larga escala) foram desenvolvidas permitindo a genotipagem simultânea de diversas regiões, com maior velocidade e menor custo relativo. O atual projeto foi desenvolvido com o objetivo de rastrear genes candidatos em pacientes portadores de HHI congênito utilizando-se o sequenciamento paralelo em larga escala, visando ampliar o conhecimento genético do HHI. Realizamos o sequenciamento paralelo em larga escala (SPLE) de 130 pacientes com HHI congênito utilizando um painel contendo 36 genes relacionados ao HHI. Inicialmente, identificamos 104 variantes, potencialmente patogênicas em 77 pacientes (59,2%). Após a filtragem inicial, foi realizada uma análise individualizada de cada variante e com isso foram mantidos 41 (31,5%) pacientes com variantes classificadas como patogênicas ou provavelmente patogênicas. Os genes KAL1, FGFR1, CHD7 e GNRHR foram os mais frequentemente afetados. Esses resultados confirmam a importância dos genes classicamente associados ao HHI congênito. Destaca-se a alta prevalência de variantes no CHD7 (10,8%), gene bastante extenso, levando à dificuldade técnica de sequenciá-lo pelos métodos tradicionais, até então sem estudos nessa coorte. O CHD7 é um gene originalmente associado à complexa síndrome de CHARGE, porém, nos últimos anos vem sendo cada vez mais associados ao HHI congênito. Dentre os resultados, ressaltamos a identificação de uma mutação inédita no gene GNRH1, causa rara de HHI, e a identificação de variantes deletérias no gene IGSF10, recentemente descrito associado ao atraso puberal, mas sem papel claro no fenótipo de HHI, em dois pacientes que tiveram reversibilidade do hipogonadismo. Variantes provavelmente patogênicas em genes com poucas descrições ou até mesmo sem relatos de associação ao fenótipo de HHI (SPRY4, FLRT3, IGSF1, NSMF, SOX10 e OTX2) também foram identificadas nessa coorte, ampliando nosso conhecimento genético do HHI. A oligogenicidade, previamente descrita com prevalência de 2,5% a 7%, em nosso estudo esteve presente em 22% dos pacientes, demonstrando uma ampliação das descrições de oligogenicidade quando comparados aos estudos prévios utilizando somente a técnica de Sanger. A nova técnica de sequenciamento genético (SPLE), utilizada em nosso estudo, foi capaz de ampliar de 22% para 31,5% (41 em 130 pacientes) a porcentagem de pacientes com diagnóstico molecular definido, quando comparado aos dados prévios utilizando a técnica de Sanger, mostrando-se rápida, confiável e eficaz / Congenital isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH) is a rare condition caused by GnRH deficiency, due to defective hypothalamic gonadotropin-releasing hormone (GnRH) production or secretion, or by pituitary resistance to the GnRH action. Congenital IHH is more prevalent in men and about 50% to 60% of affected individuals present with associated anosmia or hyposmia, characterizing Kallmann\'s syndrome. Several genes have already been associated with the pathogenesis of congenital IHH, but most cases still remain without a molecular diagnosis. Until recently, identification of the genetic causes of IHH was performed by sequencing candidate genes using the Sanger technique. However, with the growing number of genes and the genetic complexity of IHH, it has become almost impossible to keep the screening of all candidate genes updated using the traditional techniques. The advent of next-generation sequencing (NGS) has allowed the simultaneous genotyping of several regions, faster and with lower relative cost. The present project was developed with the objective of tracking candidate genes in patients with congenital IHH using large-scale parallel sequencing, in aiming to increase the genetic knowledge of this rare condition. A total of 130 unrelated patients with IHH was studied by targeted NGS, using a panel containing 36 IHH associated genes. Initially, 104 potentially pathogenic variants were identified in 77 patients (59.2%). However, after an individualized analysis of each variant, the number of patients considered to carry pathogenic or probably pathogenic variants dropped to 41 (31.5%). The genes KAL1, FGFR1, CHD7 and GNRHR were the most frequently affected and these results confirm the importance of genes classically associated with IHH. It is noteworthy the high prevalence of variants in CHD7 (10.8%), a rather extensive gene, leading to technical difficulty of sequencing by traditional methods, which had not been studied in this cohort. CHD7 is the causative gene of CHARGE syndrome, however it has been recently identified in a growing number of congenital IHH patients with or without additional features of the syndrome. Among the results, we emphasize a novel mutation in the GNRH1 gene, a rare cause of IHH, and the identification of deleterious variants in the IGSF10 gene, recently associated with pubertal delay but without a clear role in the IHH phenotype, in two patients with reversible hypogonadism. Probably pathogenic variants in genes with few descriptions or even no reports of association with the IHH phenotype (SPRY4, FLRT3, IGSF1, NSMF, SOX10 and OTX2) were also identified in this cohort, increasing the genetic knowledge of IHH. Oligogenicity, previously described with a prevalence of 2.5% to 7%, was observed in 22% of our patients, demonstrating an increase in oligogenicity cases when compared to previous studies using only the Sanger sequencing. In conclusion, targeted NGS was able to increase the percentage of patients with molecular diagnosis from 22% to 31.5% in our cohort when compared to the previous data using the Sanger sequencing, and has been shown to be a fast, reliable and effective tool in the molecular diagnosis of congenital IHH

O Hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) congênito é uma síndrome clínica rara causada por defeito na produção ou secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelo hipotálamo ou por resistência hipofisária à ação do GnRH. O HHI é mais prevalente em homens e cerca de 50% a 60% dos indivíduos afetados apresentam anosmia ou hiposmia associada, caracterizando a síndrome de Kallmann. Diversos genes já foram associados à patogênese do HHI congênito, porém, a maioria dos casos ainda permanece sem diagnóstico molecular definido. Até recentemente, a identificação das causas genéticas dos pacientes com HHI era realizada por sequenciamento de genes candidatos, empregando a técnica de Sanger. No entanto, com o número crescente de genes descritos nos últimos anos, esse processo vem se tornando impraticável. Novas metodologias de sequenciamento (sequenciamento paralelo em larga escala) foram desenvolvidas permitindo a genotipagem simultânea de diversas regiões, com maior velocidade e menor custo relativo. O atual projeto foi desenvolvido com o objetivo de rastrear genes candidatos em pacientes portadores de HHI congênito utilizando-se o sequenciamento paralelo em larga escala, visando ampliar o conhecimento genético do HHI. Realizamos o sequenciamento paralelo em larga escala (SPLE) de 130 pacientes com HHI congênito utilizando um painel contendo 36 genes relacionados ao HHI. Inicialmente, identificamos 104 variantes, potencialmente patogênicas em 77 pacientes (59,2%). Após a filtragem inicial, foi realizada uma análise individualizada de cada variante e com isso foram mantidos 41 (31,5%) pacientes com variantes classificadas como patogênicas ou provavelmente patogênicas. Os genes KAL1, FGFR1, CHD7 e GNRHR foram os mais frequentemente afetados. Esses resultados confirmam a importância dos genes classicamente associados ao HHI congênito. Destaca-se a alta prevalência de variantes no CHD7 (10,8%), gene bastante extenso, levando à dificuldade técnica de sequenciá-lo pelos métodos tradicionais, até então sem estudos nessa coorte. O CHD7 é um gene originalmente associado à complexa síndrome de CHARGE, porém, nos últimos anos vem sendo cada vez mais associados ao HHI congênito. Dentre os resultados, ressaltamos a identificação de uma mutação inédita no gene GNRH1, causa rara de HHI, e a identificação de variantes deletérias no gene IGSF10, recentemente descrito associado ao atraso puberal, mas sem papel claro no fenótipo de HHI, em dois pacientes que tiveram reversibilidade do hipogonadismo. Variantes provavelmente patogênicas em genes com poucas descrições ou até mesmo sem relatos de associação ao fenótipo de HHI (SPRY4, FLRT3, IGSF1, NSMF, SOX10 e OTX2) também foram identificadas nessa coorte, ampliando nosso conhecimento genético do HHI. A oligogenicidade, previamente descrita com prevalência de 2,5% a 7%, em nosso estudo esteve presente em 22% dos pacientes, demonstrando uma ampliação das descrições de oligogenicidade quando comparados aos estudos prévios utilizando somente a técnica de Sanger. A nova técnica de sequenciamento genético (SPLE), utilizada em nosso estudo, foi capaz de ampliar de 22% para 31,5% (41 em 130 pacientes) a porcentagem de pacientes com diagnóstico molecular definido, quando comparado aos dados prévios utilizando a técnica de Sanger, mostrando-se rápida, confiável e eficaz / Congenital isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH) is a rare condition caused by GnRH deficiency, due to defective hypothalamic gonadotropin-releasing hormone (GnRH) production or secretion, or by pituitary resistance to the GnRH action. Congenital IHH is more prevalent in men and about 50% to 60% of affected individuals present with associated anosmia or hyposmia, characterizing Kallmann\'s syndrome. Several genes have already been associated with the pathogenesis of congenital IHH, but most cases still remain without a molecular diagnosis. Until recently, identification of the genetic causes of IHH was performed by sequencing candidate genes using the Sanger technique. However, with the growing number of genes and the genetic complexity of IHH, it has become almost impossible to keep the screening of all candidate genes updated using the traditional techniques. The advent of next-generation sequencing (NGS) has allowed the simultaneous genotyping of several regions, faster and with lower relative cost. The present project was developed with the objective of tracking candidate genes in patients with congenital IHH using large-scale parallel sequencing, in aiming to increase the genetic knowledge of this rare condition. A total of 130 unrelated patients with IHH was studied by targeted NGS, using a panel containing 36 IHH associated genes. Initially, 104 potentially pathogenic variants were identified in 77 patients (59.2%). However, after an individualized analysis of each variant, the number of patients considered to carry pathogenic or probably pathogenic variants dropped to 41 (31.5%). The genes KAL1, FGFR1, CHD7 and GNRHR were the most frequently affected and these results confirm the importance of genes classically associated with IHH. It is noteworthy the high prevalence of variants in CHD7 (10.8%), a rather extensive gene, leading to technical difficulty of sequencing by traditional methods, which had not been studied in this cohort. CHD7 is the causative gene of CHARGE syndrome, however it has been recently identified in a growing number of congenital IHH patients with or without additional features of the syndrome. Among the results, we emphasize a novel mutation in the GNRH1 gene, a rare cause of IHH, and the identification of deleterious variants in the IGSF10 gene, recently associated with pubertal delay but without a clear role in the IHH phenotype, in two patients with reversible hypogonadism. Probably pathogenic variants in genes with few descriptions or even no reports of association with the IHH phenotype (SPRY4, FLRT3, IGSF1, NSMF, SOX10 and OTX2) were also identified in this cohort, increasing the genetic knowledge of IHH. Oligogenicity, previously described with a prevalence of 2.5% to 7%, was observed in 22% of our patients, demonstrating an increase in oligogenicity cases when compared to previous studies using only the Sanger sequencing. In conclusion, targeted NGS was able to increase the percentage of patients with molecular diagnosis from 22% to 31.5% in our cohort when compared to the previous data using the Sanger sequencing, and has been shown to be a fast, reliable and effective tool in the molecular diagnosis of congenital IHH

A ghrelina, hormônio secretado principalmente por células gástricas, liga-se ao seu receptor, o receptor de secretagogo de GH (GHSR - Growth hormone secretagogue receptor), localizado no hipotálamo e na hipófise, estimulando a síntese e secreção do GH. Recentemente foram identificadas mutações no gene GHSR em crianças com baixa estatura idiopática (BEI) e com deficiência isolada de GH (DGH). No presente estudo investigamos a presença de mutações no gene GHSR em crianças com DGH isolada de causa não identificada e crianças com BEI, incluindo um subgrupo de crianças com atraso constitucional de crescimento e desenvolvimento (ACCD). Foram selecionados 14 pacientes com deficiência isolada de GH sem alterações anatômicas da região hipotálamo-hipofisária e 96 pacientes com BEI, destes 31 (32%) apresentavam ACCD. Também foram estudados 150 controles adultos e 197 crianças controle com crescimento e puberdade normais. A região codificadora do GHSR foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos, seguida de purificação enzimática e seqüenciamento automático. Encontramos 6 variantes alélicas em heterozigose no GHSR: nenhuma delas presente nos controles estudados, e quatro destas variantes estão localizadas em regiões conservadas do gene. Uma variante foi encontrada em uma paciente do grupo DGH (p.Val249Leu) e as outras cinco (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) foram encontradas em pacientes do subgrupo ACCD do grupo BEI. As variantes missense foram submetidas a estudo funcional que evidenciou que as mutações p.Ser84Ile e p.Val182Ala possuem diminuição na atividade basal associadas à diminuição da expressão do receptor na superfície celular. Adicionalmente, a mutação p.Ser84Ile também apresenta redução na atividade do GHSR induzida pelo ligante. A variante p.Val249Leu foi encontrada em uma paciente do sexo feminino com diagnóstico de DGH isolado. A falta de segregação familiar associada à ausência de déficit funcional da variante nos estudos in vitro sugere que, neste caso, a variante p.Val249Leu não é a causa do fenótipo de DGH nesta família e trata-se de uma variante alélica rara. As 5 variantes alélicas no GHSR (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) encontradas nos pacientes com BEI foram identificadas apenas naqueles com puberdade atrasada, ou seja, pertencentes ao subgrupo ACCD (3 do sexo masculino e 2 do sexo feminino). A freqüência de variantes neste grupo de pacientes foi de 16%, significativamente maior que nos outros grupos, e a ausência de variantes gênicas novas no grupo de crianças obesas com altura normal e mesmo no grupo de crianças com BEI sem ACCD sugere que nosso achado não foi casual e que as alterações descritas podem estar associadas ao fenótipo de ACCD. Os estudos in vitro mostraram prejuízos funcionais em 2 destas variantes (p.Ser84Ile e p.Val182Ala) porém, devido à limitação dos estudos funcionais (celulas heterólogas) não podemos afastar que as demais não tenham algum impacto funcional in vivo. Em conclusão, nossos resultados sugerem um envolvimento dos defeitos no GHSR na etiologia do atraso constitucional do crescimento e desenvolvimento em uma parcela de pacientes com esta condição / Ghrelin, hormone secreted by gastric cells, stimulates growth hormone secretion by acting on its receptor GHSR, located in the hypothalamus and pituitary. Recently, mutations in the GHSR gene were described in patients with growth hormone deficiency (GHD) and idiopathic short stature (ISS). In the present study we analyzed the GHSR gene in patients with isolated GHD and patients with ISS, including a subgroup of patients with constitutional delay of growth and puberty (CDGP). We studied 14 GHD patients with normal pituitary magnetic resonance imaging and 96 patients with ISS, 31 of them with CDGP. We also studied 150 adults and in 197 children with normal stature. The entire coding region as well as the exon-intron boundaries of GHSR were PCR amplified in all patients and control group and PCR products were bidirectionally sequenced. Six different heterozygous variants in GHSR were identified: none of them were found in the control group and four of these amino acid substitutions occurred at a conserved position within the GHSR. One variant (p.Val249Leu) was found in a GHD patient and the other five (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were found in patients with CDGP. The missense variants were submitted to functional studies. Two of these variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) result in a decrease in basal activity that was in part explained by a reduction in cell surface expression. The p.Ser84Ile mutation was also associated with a defect in ghrelin potency. The p.Val249Leu variant, found in a female patient with isolated GHD, did not segregate with the phenotype in the family and had no functional impairment in vitro. This suggests that p.Val249Leu is not the cause of the GHD in the family and may be a rare allelic variant. The other variants (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were identified only in patients with CDGP (3 male and 2 female). The frequency of allelic variants observed in this group (16%) was higher than expected by chance in contrast with ISS and GHD children, and the absence of other GHSR mutations in the large group of control children suggests that the association between GHSR mutations and CDGP phenotype is unlikely to be fortuitous. Functional studies revealed that two of the identified missense variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) are functionally significant. These functional studies were performed in heterologous cell expression systems; therefore it is not possible to completely rule out that the other identified variants might cause some unrevealed impairment on GHSR function or expression in vivo. In conclusion, our data raise the possibility that abnormalities in ghrelin receptor function may be implicated in the ethiology of CDGP in some patients

A ghrelina, hormônio secretado principalmente por células gástricas, liga-se ao seu receptor, o receptor de secretagogo de GH (GHSR - Growth hormone secretagogue receptor), localizado no hipotálamo e na hipófise, estimulando a síntese e secreção do GH. Recentemente foram identificadas mutações no gene GHSR em crianças com baixa estatura idiopática (BEI) e com deficiência isolada de GH (DGH). No presente estudo investigamos a presença de mutações no gene GHSR em crianças com DGH isolada de causa não identificada e crianças com BEI, incluindo um subgrupo de crianças com atraso constitucional de crescimento e desenvolvimento (ACCD). Foram selecionados 14 pacientes com deficiência isolada de GH sem alterações anatômicas da região hipotálamo-hipofisária e 96 pacientes com BEI, destes 31 (32%) apresentavam ACCD. Também foram estudados 150 controles adultos e 197 crianças controle com crescimento e puberdade normais. A região codificadora do GHSR foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos, seguida de purificação enzimática e seqüenciamento automático. Encontramos 6 variantes alélicas em heterozigose no GHSR: nenhuma delas presente nos controles estudados, e quatro destas variantes estão localizadas em regiões conservadas do gene. Uma variante foi encontrada em uma paciente do grupo DGH (p.Val249Leu) e as outras cinco (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) foram encontradas em pacientes do subgrupo ACCD do grupo BEI. As variantes missense foram submetidas a estudo funcional que evidenciou que as mutações p.Ser84Ile e p.Val182Ala possuem diminuição na atividade basal associadas à diminuição da expressão do receptor na superfície celular. Adicionalmente, a mutação p.Ser84Ile também apresenta redução na atividade do GHSR induzida pelo ligante. A variante p.Val249Leu foi encontrada em uma paciente do sexo feminino com diagnóstico de DGH isolado. A falta de segregação familiar associada à ausência de déficit funcional da variante nos estudos in vitro sugere que, neste caso, a variante p.Val249Leu não é a causa do fenótipo de DGH nesta família e trata-se de uma variante alélica rara. As 5 variantes alélicas no GHSR (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) encontradas nos pacientes com BEI foram identificadas apenas naqueles com puberdade atrasada, ou seja, pertencentes ao subgrupo ACCD (3 do sexo masculino e 2 do sexo feminino). A freqüência de variantes neste grupo de pacientes foi de 16%, significativamente maior que nos outros grupos, e a ausência de variantes gênicas novas no grupo de crianças obesas com altura normal e mesmo no grupo de crianças com BEI sem ACCD sugere que nosso achado não foi casual e que as alterações descritas podem estar associadas ao fenótipo de ACCD. Os estudos in vitro mostraram prejuízos funcionais em 2 destas variantes (p.Ser84Ile e p.Val182Ala) porém, devido à limitação dos estudos funcionais (celulas heterólogas) não podemos afastar que as demais não tenham algum impacto funcional in vivo. Em conclusão, nossos resultados sugerem um envolvimento dos defeitos no GHSR na etiologia do atraso constitucional do crescimento e desenvolvimento em uma parcela de pacientes com esta condição / Ghrelin, hormone secreted by gastric cells, stimulates growth hormone secretion by acting on its receptor GHSR, located in the hypothalamus and pituitary. Recently, mutations in the GHSR gene were described in patients with growth hormone deficiency (GHD) and idiopathic short stature (ISS). In the present study we analyzed the GHSR gene in patients with isolated GHD and patients with ISS, including a subgroup of patients with constitutional delay of growth and puberty (CDGP). We studied 14 GHD patients with normal pituitary magnetic resonance imaging and 96 patients with ISS, 31 of them with CDGP. We also studied 150 adults and in 197 children with normal stature. The entire coding region as well as the exon-intron boundaries of GHSR were PCR amplified in all patients and control group and PCR products were bidirectionally sequenced. Six different heterozygous variants in GHSR were identified: none of them were found in the control group and four of these amino acid substitutions occurred at a conserved position within the GHSR. One variant (p.Val249Leu) was found in a GHD patient and the other five (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were found in patients with CDGP. The missense variants were submitted to functional studies. Two of these variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) result in a decrease in basal activity that was in part explained by a reduction in cell surface expression. The p.Ser84Ile mutation was also associated with a defect in ghrelin potency. The p.Val249Leu variant, found in a female patient with isolated GHD, did not segregate with the phenotype in the family and had no functional impairment in vitro. This suggests that p.Val249Leu is not the cause of the GHD in the family and may be a rare allelic variant. The other variants (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were identified only in patients with CDGP (3 male and 2 female). The frequency of allelic variants observed in this group (16%) was higher than expected by chance in contrast with ISS and GHD children, and the absence of other GHSR mutations in the large group of control children suggests that the association between GHSR mutations and CDGP phenotype is unlikely to be fortuitous. Functional studies revealed that two of the identified missense variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) are functionally significant. These functional studies were performed in heterologous cell expression systems; therefore it is not possible to completely rule out that the other identified variants might cause some unrevealed impairment on GHSR function or expression in vivo. In conclusion, our data raise the possibility that abnormalities in ghrelin receptor function may be implicated in the ethiology of CDGP in some patients