Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutRMRGA.pdf: 2980067 bytes, checksum: 99b0c61acbd88a69a219fe18747afa23 (MD5) Previous issue date: 2003-10-02 / Universidade Federal de Minas Gerais / Clavulanic acid (CA), a beta-lactam antibiotic, has been known for its commercial and therapeutic importance. This antibiotic is produced by an actinomicete, Streptomyces clavuligerus, and has a combined use with penicillins, acting as inhibitor of beta-lactamase enzymes. Due this importance, some studies on clavulanic acid production has been developed at DEQ-UFSCar. As a natural consequence of these studies and the global knowledge of this process it was necessary to develop a work studying clavulanic acid purification. The adsorption process was chosen to be studied as the process of clavulanic acid recovery and purification. In the present work a continuous adsorption process for clavulanic acid purification was proposed. This process utilized two stirred tanks (CSTR) with recycle of the adsorbent material. The adsorbent chosen to this process was the ion exchange resin Amberlite IRA 400 in the chloride cycle. First, it was necessary to study the adsorption and desorption kinetics and the clavulanic acid equilibrium isotherms in that resin to investigate the influence of temperature, pH and clavulanic acid initial concentration. The degradation rate of clavulanic acid in basic and acidic solutions is very high; high temperatures also increase the degradation rate. Consequently, studies on clavulanic acid degradation were carried out in the same temperature and pH conditions of the kinetics studies. A mathematical model was proposed to describe the adsorption and desorption processes and the kinetics and transport parameters were determined. The continuous process was also mathematically modeled to obtain preliminary data to carry out the clavulanic acid continuous experiments. The parameters utilized in the continuous adsorption process were optimized by response surface analysis to maximize yield and concentration and purification factors. Experiments of the continuous adsorption process were carried out in some different conditions. The continuous process like proposed was operationally viable, but the concentration and purification factors obtained were lesser than those obtained in fixedbed experiments. / O ácido clavulânico (AC), um antibiótico beta-lactâmico, vem se destacando por sua importância terapêutica e comercial. Esse antibiótico é produzido por um actinomiceto, Streptomyces clavuligerus, e tem seu uso combinado com penicilinas, agindo como inibidor das enzimas beta-lactamases. Devido a esta importância, alguns trabalhos sobre o estudo da produção de ácido clavulânico vêm sendo desenvolvidos no DEQ-UFSCar. Como seqüência natural desses trabalhos, tornou-se necessário o desenvolvimento de um trabalho sobre purificação de ácido clavulânico. Dentre os processos de recuperação de antibióticos destaca-se o processo de adsorção. No presente trabalho foi proposto o estudo do processo contínuo de purificação de ácido clavulânico por adsorção, utilizando para tal dois reatores de mistura (CSTR) com reciclo de resina. O adsorvente escolhido para esse processo foi a resina de troca iônica Amberlite IRA 400 no ciclo cloreto. Inicialmente foi necessário fazer um estudo cinético de adsorção e dessorção e das isotermas de equilíbrio do AC nessa resina, investigando a influência de fatores como concentração inicial de AC, temperatura e pH. A velocidade de degradação do ácido clavulânico é bastante alta principalmente em regiões básicas e ácidas; temperaturas altas também aumentam a velocidade de degradação deste composto. Portanto, foi necessária a realização de um estudo de degradação nas condições de temperatura e pH utilizadas no estudo cinético de adsorção. O processo de adsorção e dessorção em batelada pôde ser simulado através de um modelo matemático, obtendo-se os parâmetros cinéticos e de transporte envolvidos na adsorção. Uma modelagem matemática para o processo contínuo também foi proposta visando a obtenção de dados preliminares para realização de experimentos contínuos de adsorção de AC. Os parâmetros utilizados no processo contínuo foram otimizados através da análise por superfície de resposta de forma a maximizar o rendimento e os fatores de concentração e purificação. Os ensaios do processo de adsorção contínua foram realizados. Esse processo mostrou-se operacionalmente viável apesar de se obter fatores de concentração e purificação menores que aqueles obtidos no processo em leito fixo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutMFV.pdf: 2941614 bytes, checksum: c89443c6ac79393c7b5d25f9d4a761db (MD5) Previous issue date: 2003-11-07 / Financiadora de Estudos e Projetos / The separation/concentration process of the products obtained from the enzymatic synthesis of ampicillin (AMP) catalyzed by immobilized penicillin G acylase was the focus of this Thesis. Hydrophobic resin adsorption and isoelectric precipitation were the processes herein evaluated. The antibiotic was produced in the solid phase, from 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and phenylglycine methyl ester (PGME), and phenylglice (PG) was an undesired product. The immobilized enzyme was retained in the reactor by a sieve and the precipitated products formed (AMP and PG) were withdrawn and further dissolved at alkaline pH. After a filtration step, PG crystals were retrieved. In a second step, AMP crystals could be obtained by isoelectric precipitation. A combined process for separation/concentration of AMP, using isoelectric precipitation and hydrophobic adsorption, was put forth. The isolectric points of the molecules involved in the enzymatic synthesis were determined. In addition, the pH influence (range 5.5-7.5) on the solubility of the compounds was assessed. The results, in accordance with the literature, have shown that a pH increase leaded to an increase of the solubility of AMP and 6-APA. On the other hand, PGME solubility decreased with pH, while PG solubility was practically constant in this pH range. The adsorption efficiency and selectivity of three hydrophobic commercial resins XAD-4, XAD-7 and XAD-761 (Rohm and Haas) were evaluated at different pHs for the separation of dissolved products and unconverted reactants. Batch experiments were carried out to determine which resin had higher AMP adsorption capacity and higher selectivity (AMP/PG), at different pHs. XAD-4 was chosen: it presented higher selectivity (maximum AMP/PG = 7,0 at pH 8.5) and adsorption capacity (maximum 455 mg of AMP/g of resin, at pH 6.5). Equilibrium adsorption models were fitted: linear and Langmuir models represented PG and AMP adsorption on XAD-4 resin at pH 6.5, respectively. In a parallel work, our research group has decided to integrate synthesis and separation (precipitation of the products) in the enzymatic reactor: AMP and PG were in solid phase, and the immobilized enzyme was separated by sieving. Consequently, a combined process using isolectric precipitation and hydrophobic adsorption to separate/concentrate the AMP coming from enzymatic synthesis, with PG as impurity, was proposed. Based on the physical-chemical properties of the components, the separation process started by the elevation of pH, aiming at dissolving all AMP crystals, together with a minimum of PG crystals. Better results were obtained using pH 8.5. After filtration, un-dissolved PG was obtained. In a second step, the pH it was brought to the AMP isolectric point, causing its precipitation. Two acids and two temperatures were evaluated in this step: chloridric and sulfuric acid, 4 and 250C. Better results were obtained at 40C. No significant difference observed between the two acids. AMP crystals had purity above 97% at 40C. The following step was the separation/concentration of the mother solution, composed by a mixture of AMP and PG, using in a fixed bed of XAD-4 resin. Previously, adsorption constants, effective diffusion coefficients, and axial dispersion coefficients for AMP (at low concentrations, where a linear adsorption model fits the data) and PG were estimated by analysis of moments. The influence of temperature, flow rate, resin average particle diameter and the presence of ethanol on the performance of the system was assessed. The results obtained have shown that lower resin average particle diameters, as expected, leaded to a significant improve in the resolution of the elution curve of PG, and higher temperatures decreased retention times. The fixed bed was capable to separate, in an efficient way, a mixture of AMP and PG, reaching a separation resolution of 1.60 using a flow rate of 0.5 mL/min. Increasing ethanol concentration in the mobile phase influenced significantly the elution curves for both components. AMP de-sorption was facilitated and consequently, 5-fold and 2-fold reduction of the bed volume was achieved for AMP and PG, respectively. These results allowed the proposal of the following protocol for AMP purification, when it is reach in the solid form, containing PG as impurity: solubilization at pH 8,5 of the crystal mixture (AMP and PG), obtained from the antibiotic synthesis. Filtration of the solution, obtaining PG crystals. Reduction of the pH of the solution (containing PG, together with high concentrations of AMP), to precipitate the antibiotic at its isoelectric point. Concentration of the mother solution through adsorption on XAD-4 resin, using a water as mobile phase for adsorption and 15% (v/v) of ethanol for AMP elution. The concentrated solution should be recycled to the synthesis reactor. / Estudou-se neste trabalho o processo de Separação/concentração dos produtos da síntese de ampicilina, catalisada pela enzima penicilina G acilase imobilizada, através das técnicas de adsorção em resina hidrofóbica e precipitação no ponto isoelétrico. O antibiótico era produzido pela reação entre ácido 6-amino penicilânico (6-APA) e éster metílicode fenilglicina (EMFG), gerando também fenilglicina (FG) como sub-produto. Visando conhecimento das propriedades físico-químicas dos componentes da reação, a pesquisa se iniciou pela determinação dos pontos isoelétricos dos compostos que envolvem a reação de síntese, assim como determinação da influência do pH (na faixa de 5,5 a 7,5) na solubilidade dos mesmos. Os resultados obtidos, que estão em acordo com os disponíveis na literatura, mostraram que o aumento do pH conduz a um aumento na solubilidade da ampicilina e de 6-APA. No sentido oposto, o éster metílico de fenilglicina apresenta queda na Solubilidade com o aumento do pH, enquanto a fenilglicina mantém seu limite de solubilidade, praticamente, constante. Foram avaliadas a seguir as eficiências de adsorção e seletividades das resinas XAD-4, XAD-7 e XAD-761, a diferentes valores de pH, visando separação entre reagentes não convertidos e produtos em solução. Os resultados obtidos através de ensaios em batelada mostraram que a resina XAD-4 apresentava os melhores valores de seletividade e capacidade de adsorção. Essa resina atingiu uma razão de ampi/FG= 7,0, ou seja, a resina adsorve 7 vezes mais ampicilina do que fenilglicina a pH 8,5. e apresentou capacidade de adsorção máxima de, aproximadamente, 455 mg de ampicilina/g de resina, a pH 6,5. Diferentes modelos de equilíbrio de adsorção foram ajustados aos dados experimentais: os modelos Linear e Langmuir representaram a adsorção de FG e ampicilina sobre a resinas XAD-4 a pH 6,5, respectivamente. Em trabalho paralelo, o grupo definiu-se por processo de produção de ampicilina através de síntese integrada à Separação. Nesse processo, ampicilina e fenilglicina são obtidas na forma cristalina, separando-se o biocatalisador por peneiramento. Passou-se a avaliar assim a utilização de um processo Combinado de precipitação no ponto isoelétrico e adsorção hidrofóbica para separação e/ou concentração de ampicilina obtida por síntese enzimática, tendo como impureza fenilglicina. Baseando-se nas propriedades físico-químicas dos compostos, se iniciou o processo de separação pela elevação do pH, visando dissolução de todos os cristais de ampicilina e a menor possível de fenilglicina. Foram avaliados os valores de pH 8,5 e 9,5, sendo o pH 8,5 o escolhido como mais adequado. Através de filtração, fenilglicina pura não dissolvida podia ser obtida. Num segundo estágio, diminuía-se o pH até o ponto isoelétrico da ampicilina visando sua precipitação. Dois ácidos e duas temperaturas foram avaliados nessa etapa, clorídrico e sulfúrico, a 4 e 250C. Os melhores resultados foram obtidos a 40C, não se observando diferenças significativas para os dois ácidos, os quais permitiram atingir graus de pureza acima de 97% para ampicilina, a 40C. Estudou-se a seguir a separação e/ou concentração da solução mãe, composta de uma mistura de ampicilina e fenilglicina, através de adsorção em leito fixo, contendo a resina XAD-4 que foi previamente selecionada. Inicialmente, foram determinados os coeficientes de transferência de massa e dispersão axial para ampicilina (a baixas concentrações nas quais o modelo linear era ajustado) e fenilglicina, por análise de momento. Foram estudadas também as influências da temperatura, diâmetro médio das partículas da resina, conteúdo de etanol e vazão da fase móvel na performance do sistema. Os resultados obtidos mostraram que a diminuição no diâmetro das partículas, conforme previsto, conduzia a uma melhora significativa na resolução da curva de eluição da fenilglicina e que o aumento na temperatura (na faixa de 5 a 45oC) levou a uma diminuição dos tempos de retenção. Os resultados obtidos demonstraram ainda que a coluna foi capaz de separar de forma eficiente uma mistura de ampicilina e fenilglicina alcançando uma resolução de 1,60 para uma vazão de 0,5 mL/min. O aumento do conteúdo de etanol na fase móvel influencia de forma significativa as curvas de eluição dos compostos, facilitando a dessorção de ampicilina; obtendo-se reduções no número de volumes de leito para eluição de 5 e 2 vezes para ampicilina e fenilglicina, respectivamente. Os estudos realizados permitiram assim a proposição do seguinte protocolo para purificação de ampicilina gerada na forma sólida contendo fenilglicina como impureza: Solubilização da mistura de cristais (ampicilina e fenilglicina), obtidos durante a síntese, a pH 8,5; filtração da solução obtendo-se cristais de fenilglicina com alto grau de pureza. Redução do pH da solução (ampicilina em alta concentração e fenilglicina) para precipitação do antibiótico no seu ponto isoelétrico. Concentração da solução mãe por adsorção na resina XAD-4 e eluição com etanol 15% (v/v) de etanol, com retorno da solução concentrada ao reator de síntese.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5315.pdf: 2167736 bytes, checksum: 42c21ae0612a2550b93786bcc8cd967b (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephamycin C is a β-lactam antibiotic that belongs to the cephalosporins. This antibiotic stands out from other cephalosporins because it has activity against gram-negative bacteria and for being resistent to β-lactamases produced by pathogenic microorganisms, and which represent one of the major mechanisms of bacterial resistance to β-lactam antibiotics. In view of the restricted information in the literature about the steps of the process, both from the point of view of research and of industrial production of cephamycin C, the study about its production and, consequently, the process of separation and purification becomes of great importance. Therefore, the main objective of this work was to develop a separation and purification process of cephamycin C from a fermentation broth produced by cultivations of Streptomyces clavuligerus in aired submerged processes. Extraction and separation processes of cephamycin C were performed by means of an aqueous two-phase system (ATPS) and ionexchange chromatography, respectively. Initially, studies on the stability of cephamycin C were performed in order to allow the establishment of conditions which minimize losses and increase the yield of the global process. In these studies, conditions at pH levels of 2.2, 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 7.6 and 8.7 at a temperature of 20 °C were evaluated. The smallest half-life was of 52.6 hours and was verified for pH 8.7; the longest half-life was of 459 hours for pH 6.0; and for the most acid pH (2.2), half-life was of 118.2 hours. The second step of the work was the study of the separation of cephamycin C and amino acids with the aqueous two-phase system composed by PEG/phosphate. The presence of ornithine, lysine and asparagine amino acids in the fermentation broth, even after the primary separation steps performed by filtration processes consisting of microfiltration and ultrafiltration, is due to the composition of the culture medium which is of complex origin. The experiments were carried out by varying the following parameters: molecular mass of PEG (400, 600, 1000 and 4000), pH (6, 7 and 8), tieline length (TLL 37 and 43) and phase volume ratio (rTLL 0.75, 1.00 and 1.25), in order to enable the determination of the best system for cephamycin C extraction. The best conditions obtained for this process were pH 8, PEG 400, TLL 43 and rTLL 1.00, where the highest partition coefficient, kp of 5.57, was acquired. For the separations of cephamycin C and the amino acids present in the broth, it was possible to verify the following separation efficiencies: 3.4 (ornithine), 6.9 (lysine) and 2.8 (asparagine). The last step of the work showed that it is possible to recover cephamycin C from the PEG phase promoting an even greater purification with the residual amino acids. The ion-exchange chromatography was used to propose so. For this proposal, we used the ion exchange chromatographic technique, with use of anionic resin Amberlite IRA 400. These experiments were performed under temperatures of 20, 25 and 30 °C and pH 2.8 and 6.8. The Amberlite IRA 400 Cl- resin showed affinity for cephamycin C, and in the experiments in fixed bed column, it was possible to separate cephamycin C from PEG, from the phosphate salt and from the amino acids present in the top phase. The results allowed the conclusion that the proposed process is an excellent alternative for the extraction, separation and purification of cephamycin C. / A cefamicina C (cef C) é um antibiótico β-lactâmico que pertence à classe das cefalosporinas. Este antibiótico se destaca das demais cefalosporinas por possuir atividade frente a bactérias gram-negativas e ser resistente à ação das β-lactamases, produzidas por micro-organismos patogênicos, e que representam um dos principais mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo, tanto sob o ponto de vista de pesquisa e industrial de produção da cefamicina C, torna-se de grande importância o estudo de sua produção e consequentemente do processo de separação e purificação. Portanto, o objetivo principal deste trabalho foi desenvolver um processo de separação e purificação da cefamicina C, a partir de um caldo fermentado produzido por cultivos da bactéria Streptomyces clavuligerus, em processos submersos aerados. Os processos de extração e separação da cefamicina C foram realizados por meio de sistema de duas fases aquosas (SDFA) e cromatografia de troca iônica em coluna de leito fixo, respectivamente. Inicialmente, foram realizados estudos de estabilidade da cefamicina C, tendo em vista permitir o estabelecimento de condições que minimizem as perdas e aumentem o rendimento do processo global. Nestes estudos foram avaliadas as condições em pH de 2,2, 3,3, 5,0, 6,0; 7,0; 7,6 e 8,7 a uma temperatura de 20 °C. A meia-vida para o pH 8,7 foi de 52,6 horas, para o pH 6,0 a meia-vida foi de 459 horas e, para o pH mais ácido (2,2), a meia-vida foi de 118,6 horas. A segunda etapa do trabalho correspondeu ao estudo da separação entre a cefamicina C e os aminoácidos, por meio do sistema de duas fases aquosas composto por polietileno glicol (PEG) /fosfato. A presença dos aminoácidos ornitina, lisina e asparagina no caldo fermentado, mesmo após as etapas de separação primária, realizada por processos de filtração compostos por microfiltração e ultrafiltração, devem-se a composição do meio de cultura de origem complexa. Os experimentos foram realizados variando-se os seguintes parâmetros: massa molecular de PEG (400, 600, 1000 e 4000), pH (6, 7 e 8), tamanho de tieline (TLL 37 e 43) e razão de volume das fases (rTLL 0,75, 1,00 e 1,25), de modo a possibilitar a determinação do melhor sistema para a extração da cefamicina C. As melhores condições obtidas para este processo foram pH 8, PEG 400, TLL 43 e rTLL 1,00, onde se obteve o maior coeficiente de partição, kp de 5,57. Para as separações entre a cef C e os aminoácidos presentes no caldo foi possível verificar as seguintes eficiências de separação: 3,4 (ornitina), 6,9 (lisina) e 2,8 (asparagina). Na etapa final do trabalho foi possível recuperar a cef C da fase PEG, promovendo ainda uma maior purificação com os aminoácidos residuais. Para tal proposta, utilizou-se a técnica cromatográfica de troca iônica, com utilização da resina aniônica Amberlite IRA 400. Estes experimentos foram realizados sob temperaturas de 20, 25 e 30 °C e pH 2,8 e 6,8. A resina Amberlite IRA 400 mostrou afinidade em relação à cef C, e nos experimentos em coluna de leito fixo, foi possível separar a cef C do PEG, do sal de fosfato e dos aminoácidos presentes na fase de topo. Os resultados obtidos permitiram concluir, que o processo proposto mostrou-se viável para a extração e separação da cefamicina C.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLMB.pdf: 688899 bytes, checksum: 1da3502ed4adcb1c200a2f4d30584493 (MD5) Previous issue date: 2005-10-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / A study was made of the extraction of clavulanic acid (CA) from a fermented medium and its concentration and purification, based on a comparison of two liquid-liquid extraction methods, followed by adsorption in a fixed bed column containing resins (hydrophobic polymeric resin and ion exchange resin). The extraction and adsorption steps proposed here were evaluated from the standpoint of Yield (Y), purification factor (PF) and concentration factor (CF). The extractions were carried out with the organic solvents ethyl acetate, butyl acetate, 2-butanol, n-butanol and methyl isobutyl ketone. These extractions were carried out at ambient temperature, pH values of 2.0, 3.0, 4.0 and 5.0 and with different volume ratios of aqueous phase and organic phase (VAF/VOP). After extraction with the organic solvent, the solution was reextracted with a phosphate buffer solution. Extractions were also done with two-phase aqueous systems (TPAS) composed of polyethylene glycol (PEG) and phosphate. The experimental conditions were: ambient temperature, pH of 6.0 and 7.0, and different molecular weights of PEG (400, 600, 4000). For the extractions involving organic solvents, an evaluation was made of the purification of clavulanic acid by ion exchange adsorption with Amberlite IRA-400 resin in a fixed bed column at a temperature of 10°C and pH 6.2. After adsorption by ion exchange, the column was washed with Milli-Q water and the elution was studied with different compositions of a solution composed of NaCl 5% (p/v) and Tris-HCl. The elution was carried out at pH 6.2 and a feed flow of approximately 6 mL.min-1. The solution eluted from the ion exchange was fed into a column filled with Amberlite XAD-4 resin at a temperature of 10°C and pH of 6.2. For the TPAS extractions, the application of ion exchange and nonspecific adsorption with Amberlite XAD-4 resin for the separation of CA from PEG was evaluated separately. / Propôs-se e estudou-se a extração do ácido clavulânico do meio fermentado, sua concentração e purificação, através da comparação de dois métodos de extração líquidolíquido, seguida de adsorção em coluna de leito fixo com as resinas (polimérica hidrofóbica e de troca iônica). As etapas de extração e adsorção, propostas neste trabalho, foram avaliadas em termos do Rendimento (R), o fator de purificação (FP) e o fator de concentração (FC). Para isso foram realizadas extrações com vários solventes orgânicos, sendo estes o acetato de etila, acetato de butila, 2-butanol, n-butanol e metil-isobutilcetona. Estas extrações foram feitas na temperatura ambiente, diferentes valores de pH (2,0; 3,0; 4,0 e 5,0) e em diferentes razões de volume entre as fases aquosa e orgânica (VFA/VFO). Após a extração com o solvente orgânico, a solução foi re-extraída com uma solução tampão fosfato. Também foram realizadas extrações com sistemas de duas fases aquosas (SDFA) formadas por polietileno glicol (PEG) e fosfato. As condições experimentais foram: temperatura ambiente; pH de 6,0 e 7,0; e diferentes pesos moleculares de PEG (400, 600, 4000). Para as extrações realizadas com solventes orgânicos, foi avaliada a purificação do ácido clavulânico através de adsorção por troca iônica com a resina Amberlite IRA-400 em coluna de leito fixo, na temperatura de 10ºC e pH 6,2. Após a adsorção por troca iônica a coluna foi lavada com água milli Q, sendo que a eluição foi estudada com diferentes composições da solução constando de NaCl 5% (p/v) e tris - HCl. A eluição foi realizada a pH 6,2 e vazão de alimentação em torno de 6 mL.min-1. A solução eluída da troca iônica foi alimentada em uma coluna recheada com a resina Amberlite XAD-4, na temperatura de 10°C e pH de 6,2. Para as extrações com SDFA avaliou-se separadamente a aplicação da troca iônica e da adsorção não específica com a resina Amberlite XAD-4, para a separação do AC do PEG.