Fosforribosil pirofosfato (PRPP) sintetases são enzimas de central importância em diversas vias metabólicas em todas as células. A enzima PRPP sintetase humana é constituída por um complexo composto de três subunidades catalíticas (PRSI, PRSII e PRSIII) e por proteínas homólogas de 39 e 41 kDa denominadas PRS Associated Proteins (PAPs) cuja função é desconhecida. A importância da PRPP sintetase em humanos, tem sido documentada pela identificação de uma desordem associada ao cromossomo X, resultando em uma atividade aumentada da PRPP sintetase.Em conseqüência se percebem concentrações elevadas na dosagem de ácido úrico, purino nucleotídeos levando ao desenvolvimento de patogenias como a gota e problemas neurológicos. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares com o complexo enzimático que compõem as PRPP sintetases. Foram obtidos clones do gene hprsI em vetor de expressão pET29a(+) e a enzima foi expressa em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante hPRSI foi purificada depois de fracionamento com sulfato de estreptomicina, sulfato de amônio e em coluna cromatográfica de troca iônica. O raio hidrodinâmico e o pI da enzima foram determinados usando respectivamente a técnica de espalhamento dinâmico de luz e o sistema Fast de eletroforese. A enzima foi caracterizada quanto ao seu enovelamento através da técnica de Dicroísmo Circular, apresentando um espectro característico de estrutura enovelada, composta predominantemente por a-hélices. Os genes hprsII e hpap4l-1 que codificam respectivamente para as proteínas hPRSI1 e HPAP41-1 foram clonados no vetor de clonagem pCR4-TOPO. A proteína recombinante hPAP39 foi clonada em vetor pMAL-c2X em fusão com a proteína Maltose Binding Protein (MBP) e expressa em E. coli. A proteína hPAP39 está em fase de purificação e foi submetida ao experimento de Imunoblotting. Investigações estruturais destas enzimas poderão trazer informações fundamentais para o conhecimento da via biossintética, assim como para o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento das desordens a elas associadas. / Phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) synthetases are enzymes of central importance in several metabolic pathways in all cells. The enzyme PRPP synthetase complex is composed of three catalytic subunitis (PRSI, PRSII and PRSIII) and homologous 39 and 41 kDa proteins termed PRPP synthetase-Associated Proteins (PAPs) which function is unknown. The importance of PRPP synthetase function in humans has been documented by the identification of an X chromosome-linked disorder associated with super activity of PRPP synthetase. As a consequence uric acid overproduction, purine nucleotide are observed resulting in the development of diseases such as gout and neurodevelopment impairment. In this line, molecular studies were done with the enzyme complex that constitutes the PRPP synthetases. Clones were obtained from the hprsI gene in the pET29a(+) expression vector and the enzyme was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) bacterial. The recombinant human PRSI enzyme was purified, after streptomicine and ammonium sulfate fractionation and by anion exchange chromatography. The hPRSI hydrodynamic radius and pI were determined using, respectively, measures of Dynamic Light Scattering (DLS) and isoeletrophocusing electrophoresis. In addition, according to circular dichroism spectroscopy, hPRSI prevalent secondary structure is a-helix. The hprsí and hpap41-1 genes that codify, respectively, to hPRSII and hPAP41-1 proteins were cloned in pCR4-TOPO cloning vector. The recombinant protein hPAP39 was cloned in the pMAl-c2X expression vector in fusion with the Maltose Binding Protein (MBP) and expressed in E.coli. A purification protocol is been establish for the hPAP39 protein and is submitted by imunoblotting technique. Structural investigation of these enzymes will provide information about the biosynthetic pathway de novo of purine nucleotides, as well as to development of specific inhibitors aiming at the treatment of the associated disorders.

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.

Fosforribosil pirofosfato (PRPP) sintetases são enzimas de central importância em diversas vias metabólicas em todas as células. A enzima PRPP sintetase humana é constituída por um complexo composto de três subunidades catalíticas (PRSI, PRSII e PRSIII) e por proteínas homólogas de 39 e 41 kDa denominadas PRS Associated Proteins (PAPs) cuja função é desconhecida. A importância da PRPP sintetase em humanos, tem sido documentada pela identificação de uma desordem associada ao cromossomo X, resultando em uma atividade aumentada da PRPP sintetase.Em conseqüência se percebem concentrações elevadas na dosagem de ácido úrico, purino nucleotídeos levando ao desenvolvimento de patogenias como a gota e problemas neurológicos. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares com o complexo enzimático que compõem as PRPP sintetases. Foram obtidos clones do gene hprsI em vetor de expressão pET29a(+) e a enzima foi expressa em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante hPRSI foi purificada depois de fracionamento com sulfato de estreptomicina, sulfato de amônio e em coluna cromatográfica de troca iônica. O raio hidrodinâmico e o pI da enzima foram determinados usando respectivamente a técnica de espalhamento dinâmico de luz e o sistema Fast de eletroforese. A enzima foi caracterizada quanto ao seu enovelamento através da técnica de Dicroísmo Circular, apresentando um espectro característico de estrutura enovelada, composta predominantemente por a-hélices. Os genes hprsII e hpap4l-1 que codificam respectivamente para as proteínas hPRSI1 e HPAP41-1 foram clonados no vetor de clonagem pCR4-TOPO. A proteína recombinante hPAP39 foi clonada em vetor pMAL-c2X em fusão com a proteína Maltose Binding Protein (MBP) e expressa em E. coli. A proteína hPAP39 está em fase de purificação e foi submetida ao experimento de Imunoblotting. Investigações estruturais destas enzimas poderão trazer informações fundamentais para o conhecimento da via biossintética, assim como para o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento das desordens a elas associadas. / Phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) synthetases are enzymes of central importance in several metabolic pathways in all cells. The enzyme PRPP synthetase complex is composed of three catalytic subunitis (PRSI, PRSII and PRSIII) and homologous 39 and 41 kDa proteins termed PRPP synthetase-Associated Proteins (PAPs) which function is unknown. The importance of PRPP synthetase function in humans has been documented by the identification of an X chromosome-linked disorder associated with super activity of PRPP synthetase. As a consequence uric acid overproduction, purine nucleotide are observed resulting in the development of diseases such as gout and neurodevelopment impairment. In this line, molecular studies were done with the enzyme complex that constitutes the PRPP synthetases. Clones were obtained from the hprsI gene in the pET29a(+) expression vector and the enzyme was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) bacterial. The recombinant human PRSI enzyme was purified, after streptomicine and ammonium sulfate fractionation and by anion exchange chromatography. The hPRSI hydrodynamic radius and pI were determined using, respectively, measures of Dynamic Light Scattering (DLS) and isoeletrophocusing electrophoresis. In addition, according to circular dichroism spectroscopy, hPRSI prevalent secondary structure is a-helix. The hprsí and hpap41-1 genes that codify, respectively, to hPRSII and hPAP41-1 proteins were cloned in pCR4-TOPO cloning vector. The recombinant protein hPAP39 was cloned in the pMAl-c2X expression vector in fusion with the Maltose Binding Protein (MBP) and expressed in E.coli. A purification protocol is been establish for the hPAP39 protein and is submitted by imunoblotting technique. Structural investigation of these enzymes will provide information about the biosynthetic pathway de novo of purine nucleotides, as well as to development of specific inhibitors aiming at the treatment of the associated disorders.

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.