Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La découverte d’oxyde nitrique synthases (NOS) chez les bactéries a imposé un questionnement quant à la fonction de l’oxyde nitrique (NO) chez les microorganismes. Chez les mammifères, le NO remplit des fonctions de signalisation et de stress pour lesquelles il n’y a aucun équivalent chez les bactéries. Des études ont démontré que in vitro, comme chez les NOS animales (mNOS), les NOS bactériennes (bNOS) peuvent catalyser la conversion du L-arginine en L-citrulline et libérer du NO. Cependant, il a été découvert que les bNOS de Deinococcus radiodurans et Streptomyces turgidiscabies pouvaient catalyser la nitrosation de groupements trytophanyles. Jusqu’à maintenant ces études soutiennent l’hypothèse que les bNOS synthétisent du NO lors d’un processus de catalyse semblable à celui des mNOS. Cependant, elles indiquent que sa fonction pourrait être de modifier une molécule au site du cofacteur. Nous avons proposé l’étude des propriétés cinétiques et structurales des bNOS de Bacillus subtilis (BsNOS) et Staphylococcus aureus (SaNOS) afin d’investiguer le mécanisme catalytique des bNOS, d’approfondir les connaissances de la catalyse chez les NOS en général et d’explorer les particularités de ces enzymes susceptibles de révéler leur fonction. Nos études ont porté sur les caractéristiques structurales du site actif de SaNOS et BsNOS, sur les cinétiques de formation et de disparition du complexe oxygéné chez SaNOS, sur les interactions des substrats avec les ligands de l’hème et sur le rôle du cofacteur chez les bNOS. Nos résultats montrent que SaNOS et BsNOS peuvent catalyser les mêmes réactions biochimiques que les mNOS et apportent des éléments nouveaux permettant de mieux comprendre le mécanisme d’activation du complexe oxygéné, une étape cruciale à la catalyse. Par ailleurs, certaines ressemblances observées entre SaNOS, BsNOS et les mNOS ont révélé des propriétés conservées chez ces enzymes qui sont importantes pour la production et la fonction du produit synthétisé. Notamment la spécificité des interactions des différents substrats avec les ligands de l’hème et la déformation de la molécule d’hème. Cependant des différences reliées aux effets structuraux du cofacteur ont été observées et s’ajoutent à celles découvertes chez les autres bNOS qui indiquent que la fonction de ces enzymes pourrait se distinguer de celle des mNOS. / The discovery of nitric oxide synthases (NOS) in bacteria has raised many questions regarding the function nitric oxide (NO) might fulfill in prokaryotes. In mammals, NO is implicated in signal and stress events for which no equivalent functions exist in bacteria. In vitro studies have revealed that, like mammalian NOS (mNOS), bacterial NOS (bNOS) catalyze the hydroxylation of L-arginine to L-citrulline and release NO. In addition, it has been shown that the bNOS of Deinococcus radiodurans and Streptomyces turgidiscabies catalyse the nitrosation of tryptophanyl compounds. As of now these studies support the hypothesis that bNOS synthesize NO in a catalytic process similar to the one described for mNOS. However, these studies also indicated that the newly synthesized NO might be used to modify a molecule bound to the cofactor binding site. We proposed the investigation of the kinetic and structural properties of the bNOS of Bacillus subtilis (BsNOS) and Staphylococcus aureus (SaNOS) to probe the catalytic mechanism of bNOS, deepen our understanding of catalysis in NOS and explore the distinctive features of these new enzymes that might reveal their function. Our studies targeted the structure of the active site of SaNOS and BsNOS, the kinetics of formation and decay of the oxygenated complex of SaNOS, the interactions of the substrates with heme-bound ligands and the function of the cofactor in bNOS. Our results support the proposal that bNOS are able to catalyze the same biochemical reactions than those carried out by mNOS and bring new information that provide us with a better understanding of the mechanism of oxygen activation, a crucial step during catalysis. In addition the observation of some similarities between SaNOS, BsNOS and mNOS revealed conserved features in these enzymes that are important for the synthesis and function of the product. Notably the specificity of the interactions the two substrates make with the heme-bound ligands and the deformation of the heme molecule. Meanwhile structural differences related to the cofactor have been observed, and in addition to those observed in the other bNOS, point to a novel function for these enzymes.

Le virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) est un virus filamenteux flexible dont son unique protéine structurale est la protéine de capside (CP), composée de 215 acides aminés. La structure tertiaire de cette protéine, tout comme celle de ses homologues, n'est pas connue. Le but de ce projet est de caractériser la structure et la dynamique de la PapMV CP par RMN multidimensionnelle. Afin d'y arriver, une forme de protéine utilisable pour la RMN, d'un poids moléculaire évitant d'outrepasser les 30 kDa, a d'abord été identifiée : la PapMV CP27-215. Un protocole d'expression à haut rendement a été développé et nous avons marqué cette protéine avec le 15N et le 13C, ce qui impliquent une expression en milieu minimum. La RMN est aussi une méthode qui exige une très grande pureté de la protéine. Par conséquent, une approche de purification efficace a été développée. En plus d'une protéine pure et marquée, la RMN exige que celle-ci soit soluble, concentrée et stable. Ces exigences ont été répondues afin de répondre à l'objectif premier de ce projet.