Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-11-17T19:30:12Z No. of bitstreams: 1 Alene Vanessa Azevedo dos Santos. Reacoes de oxido reducao como alvo de quimioterapia triconomicida.pdf: 13103565 bytes, checksum: ad5cc355a7ef3d05b87bd59e85b6f9e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-17T19:30:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alene Vanessa Azevedo dos Santos. Reacoes de oxido reducao como alvo de quimioterapia triconomicida.pdf: 13103565 bytes, checksum: ad5cc355a7ef3d05b87bd59e85b6f9e0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Trichomonas vaginalis e Tritrichomonas foetus são os agentes etiológicos da tricomoníase humana e bovina, respectivamente. A primeira é uma parasitose de grande importância em saúde pública, sendo a principal doença sexualmente transmissível não viral e a segunda ocasiona extensos prejuízos econômicos na pecuária. A tricomoníase humana pode promover a incidência de câncer de colo de útero e a transmissão do HIV. Na infestação humana a droga de escolha é o metronidazol, mas não há um composto eficiente para o tratamento de bovinos. Como este fármaco é usado para outras parasitoses e infecções bacterianas desde a década de 60, tem sido documentado o surgimento de casos refratários e cepas resistentes. Além disso, o fármaco pode ter efeitos mutagênicos e carcinogênicos. Assim sendo a busca por novos compostos tricomonicidas constitui uma demanda premente. No presente estudo foram avaliados os efeitos do dietilditiocarbamato de sódio (DETC) sobre os protozoários parasitas T. vaginalis e T. foetus. Observamos que a adição de DETC inibiu significativamente a proliferação de T. vaginalis, produzindo uma IC50 de 269,7nM, enquanto o metronidazol teve uma IC50 de 523,1nM. Em T. foetus os valores de IC50 foram semelhantes, sendo 497,8 e 459,7nM para o DETC e para o metronidazol, respectivamente. Estes compostos não afetaram significativamente a incorporação de [3H]timidina por esplenócitos murinos em concentrações de até 1000M. A atividade mitocondrial de macrófagos peritoneais murinos também não foi afetada por DETC, mesmo em 200μM, sugerindo seletividade no modo de ação. Objetivando determinar a existência de sinergismo entre DETC e metronidazol, foram determinados os valores de FIC (concentração inibitória fracionada) para os dois protozoários. Os valores de FIC foram 0,3 e 0,7 para T. vaginalis e T. foetus, respectivamente. Esta observação indica que ocorre a interação sinergística no protozoário parasita de humanos. A fim de determinar se a incubação com DETC poderia afetar a expressão de grupos sulfidrila dos parasitos empregamos a reação de Ellman para dosar os grupamentos tiol totais de T. vaginalis antes e após a adição do composto. Observamos que o tratamento com DETC por 24h significativamente (p<0,01) reduziu a concentração de grupos tióis do parasito. A detecção de tióis livres pela sonda fluorescente orto-phthalaldeído (OPA) em T. foetus sugere a participação de sulfidrilas no mecanismo de ação do DETC, uma vez que este reduz marcadamente a marcação dos parasitos pelo OPA, mas este efeito foi revertido pela pré-incubação com cisteína. Vale salientar que o aminoácido reverte, ainda, os efeitos do composto na proliferação parasitária. A mensuração de radicais livres por quimioluminescência amplificada pelo luminol indicou que a geração de espécies reativas de oxigênio foi significativamente (p <0,05) aumentada por DETC em T. vaginalis, mas não em T. foetus. O estresse oxidativo sobre os parasitas foi avaliado pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs). Observou-se que a combinação metronidazol-DETC significativamente aumenta a peroxidação lipídica em T. vaginalis (p <0,01) e T. foetus (p <0,05). A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão revelou que tanto DETC quanto o metronidazol produziram danos hidrogenossomais e desencadearam autofagia e esses efeitos foram mais acentuadas no parasitas incubados com a combinação de drogas. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a combinação metronidazol-DETC pode fornecer novas ferramentas para a efetiva quimioterapia da tricomoníase / Trichomonas vaginalis e Tritrichomonas foetus are the etiologic agents of the human and bovine trichomoniasis, respectively. The former is a parasitic disease of great relevance in public health – the major non-viral sexually-transmitted disease, whereas the latter causes remarkable losses in livestock productivity. Human trichomoniasis can promote the incidence of cervical cancer and HIV transmission. In human infestation the drug of choice is metronidazole, but there is no efficient compound for treating the cattle. Since the medication is also used for other parasitic and bacterial diseases, since the 60s, refractory cases and resistant strains have been documented. Besides, the drug may be mutagenic and carcinogenic. Therefore the search for new trichomonicidal compounds is required. In the present study we investigated the effects of sodium N,N-diethylthiolcarbamate (DETC) alone or combined with metronidazole upon the parasitic protozoa T. vaginalis and T. foetus. We notice that DETC significantly inhibited the T. vaginalis proliferation, producing an IC50 of 269.7nM, whereas metronidazole produced an IC50 of 523.1. In T. foetus the IC50 values were similar, being 497.8 and 459.7nM for DETC and metronidazole, respectively. These compounds did not significantly affect the incorporação de [3H]timidine incorporation by murine splenocytes in concentrations up to 1000μM. The mitochondrial activity of murine peritoneal macrophages was not affected by 200μM DETC, suggesting a selective mode of action. In order to determine whether there is synergism between DETC and metronidazole, we determined the fractional inhibitory concentrations (FIC) of these compounds upon both protozoa. The FIC values for T.vaginalis and T. foetus were 0.3 and 0.7, respectively. This observation indicates that synergistic interaction takes place only on the human pathogen. To determine whether the incubation with DETC could affect the expression of sulphydril groups of parasites we employed the Ellman’s reaction to measure the total thiol groups of T. vaginalis before and after the addition of the compound. We observed that treatment with DETC for 24h significantly (p <0.01) reduced the concentration of thiol groups of the parasite. The detection of free thiols by the fluorescent probe ortho- phthaldialdehyde (OPA) in T. foetus suggests the involvement of sulphydrils in the DETC mechanism of action, since it markedly reduces the OPA labeling of parasites, but this effect was reversed by cysteine preincubation with. It is noteworthy that the amino acid addition also reverts, the effects of the compound on the parasite proliferation. The measurement of free radicals by luminol-enhanced chemiluminescence indicated that reactive oxygen species generation was significantly (p <0.05) enhanced by DETC in T. vaginalis, but not T. foetus. The oxidative stress on the parasites was evaluated by measurement of the thiobarbituric acid-reactive substances (TBARs). We observed that the metronidazole-DETC combination significantly enhanced lipid peroxidation in T. vaginalis (p <0.01) and T. foetus (p <0.05). The ultrastructural analysis by transmission electron microscopy revealed that both DETC and metronidazole produced hydrogenosomal damage and triggered autophagy and these effects were more pronounced on the parasites incubated with the combined drugs. Taken together these data suggest that the metronidazole-DETC combination may furnish new tools in the effective chemotherapy of trichomoniasis.