Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) luana_ferreira_ioc_mest_2009.pdf: 2254702 bytes, checksum: 40f4b71b46737ba469bce20ef19d9181 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Várias populações de Aedes aegypti, vetor da dengue e da febre amarela urbana, apresentaram resistência aos inseticidas clássicos utilizados em seu controle. Sendo assim, torna-se imperativo o estabelecimento de estratégias alternativas. Nesse sentido, a biossíntese de quitina é um alvo potencial. Em artrópodes, a quitina é considerada o principal constituinte da cutícula (ou exoesqueleto). A quitina Sintase (do inglês Chitin Synthase, CHS) é uma enzima-chave na biossíntese desta molécula, e os compostos benzoil-fenil-uréias (BPUs) possuem atividade inibidora da síntese de quitina, interferindo na formação da cutícula em diversas espécies de insetos. Novaluron é um BPU recentemente recomendado pela WHO para uso em água potável, o que o qualifica como uma alternativa viável para o controle de larvas do vetor da dengue. Neste trabalho investigamos, durante o desenvolvimento larvar de Ae. aegypti, a influência de novaluron sobre: 1) o conteúdo de quitina; 2) a expressão do gene AaCHS1, evidenciada por seus transcritos alternativos AaCHS1a e AaCHS1b e, 3) a estrutura do exoesqueleto e da membrana peritrófica. Para tanto, inicialmente foi necessário observar os momentos das ecdises larvais. Os pontos definidos para a coleta das amostras levaram em conta o processo de síntese de cutícula a cada instar larvar. Foram escolhidos pontos tentativamente representativos do início (i), meio (int) e fim (f) do terceiro (L3) e do quarto (L4) instares. Os pontos de L3i, L3int, L3f, L4i, L4int e L4f foram definidos como 53, 59,5, 68, 75, 92,5 e 98 horas após a eclosão (HAE), respectivamente. Novaluron foi então administrado continuamente a larvas L3, a partir de 51 HAE, em concentrações definidas em relação ao seu percentual de inibição de emergência do adulto (IE): IE20, IE50 e IE99. Foi observado um aumento significativo no conteúdo de quitina de larvas controle, desde L3i até L4f. Novaluron afetou significativamente a produção de quitina de forma dose-dependente, ao longo do desenvolvimento larvar. A abundância relativa de mRNA dos transcritos AaCHS1a e AaCHS1b foi avaliada por PRC quantitativo em tempo real, de L3i e L4f, em larvas controle e tratadas com dose de IE99. O perfil de expressão dos transcritos AaCHS1a e AaCHS1b é similar em larvas controle, ainda que a variação temporal de AaCHS1b seja maior. O BPU parece ter um efeito mais proeminente sobre o perfil de expressão de AaCHS1b, que se acentua nas primeiras horas após tratamento. Com base nos resultados obtidos, duas hipóteses são discutidas: mecanismo de feedback positivo ou atraso fisiológico do desenvolvimento. Ensaios histológicos preliminares validaram a metodologia utilizada para preparo e observação da morfologia de larvas tratadas e controle. Cortes longitudinais evidenciaram a preservação de estruturas internas, inclusive as quitinosas, o que abre a perspectiva de ensaios futuros de marcação específica para quitina / Several populations of Aedes aegypti , vector of dengue and urban yellow fever, exhibit resistance to insecticides used on their control. T herefore, the establishment of alternative strategi es becomes imperative. In this regard, chitin biosynth esis is a potential target. In arthropods, chitin i s considered the main constituent of the cuticle (or exoskeleton). Chitin Synthase (CHS) is a key enzyme in the biosynthesis of this molecule and, Be nzoyl-phenyl-urea (BPU) compounds inhibit chitin synthesis, interfering with cuticle formation in se veral insect species. Novaluron was recently recommended by WHO for use in potable water, which qualifies this BPU as a viable alternative to the control of the dengue vector larvae. In the present work we investigated the influence of novaluron, during larval development of Ae. aegypti , on the: 1) chitin content, 2) AaCHS1 gene expression, through its alternative spliced forms AaCHS1a and AaCHS1b , and 3) exoskeleton and peritrophic membrane structure. For this purpose, it was first necessary to observe the timing of larval ecdysis. The time points selected for sampling took into acc ount the process of cuticle synthesis at each larva l instar. Tentative initial (i), intermediary (int) a nd final (f) representative time points were chosen for the third (L3) and fourth (L4) larval instars. The poin ts of L3i, L3int, L3f, L4i, L4int and L4f were defi ned as 53, 59.5, 68, 75, 92.5 and 98 hours after hatching (HAH), respectively. Novaluron was continuously administered to L3 larvae, from 51 HAH on at concen trations defined with respect to the percentage of adult emergence inhibition (EI): EI 20 , EI 50 and EI 99 . In control larvae, a significant increase of the chitin content, from L3i until L4f, was observed. Novaluro n significantly affected chitin production in a dos e dependent manner, during larval development. The re lative abundance of AaCHS1a and AaCHS1b transcripts was evaluated by quantitative real time PCR, from L3i to L4f, on both control and novaluro n IE 99 larvae. The expression of AaCHS1a the treated larvae were similar to control. The ex pression profile of both AaCHS1a and AaCHS1b transcripts is similar in control larvae, even if variations in AaCHS1b are higher. BPU treatment effect seems more pronou nced on AaCHS1b expression profile, that is activated in the first hours immediately fo llowing treatment. Two hypotheses are raised: a positive feedback mechanism or a physiological deve lopment delay. Preliminary histological observations validated the methodology employed for preparing and observing control and treated larvae morphology. Longitudinal sections put in evi dence the preservation of internal structures, including chitinized ones, opening the perspective of future assays for specific chitin.