Mon étude a porté sur le rôle du récepteur purinergique P2X7 (P2X7R) dans les processus physiopathologiques impliqués dans le développement des maladies auto-immunes de type lupique. Les souris MRL/lpr, déficientes en récepteurs d’apoptose Fas (mutation lpr), développent spontanément ces pathologies suite à l’accumulation lymphocytes T pathogéniques CD4−CD8− (DN) B220+ dans les organes lymphoïdes secondaires. Nous avons observé que ces lymphocytes ont également un déficit d’expression en P2X7R à leur surface. Cela nous a amené à postuler que P2X7R pourrait jouer un rôle clé dans l’homéostasie des lymphocytes T et le développement du lupus. Afin de vérifier notre hypothèse, nous avons produit des souris C57BL/6J (B6) déficientes simultanément pour Fas (lpr) et P2X7R (P2X7KO). Ces souris présentent une accumulation massive de lymphocytes T DN B220+ et des titres très élevés en auto-anticorps et en cytokines proinflammatoires ce qui n’est pas le cas pour les souris B6 simples mutantes lpr ou P2X7KO confirmant pour la première fois l’implication de P2X7R dans l’homéostasie des lymphocytes T, en synergie avec le récepteur Fas. Les lymphocytes T DN pathogéniques responsables de la lymphoaccumulation sont issues majoritairement de la sous populations des lymphocytes T CD8+. L’inflammation chronique présente chez les souris B6/lpr P2X7KO induit l’activation de l’ensemble des populations lymphocytaires T CD4+ et CD8+ naïves conduisant à l’accumulation de lymphocytes T Effecteurs/Mémoires : EM et CM et atteignent parfois le stade exhausted PD1+TIM3+. Ces cellules accumulées CD4+, CD8+ et DN B220+ ont une capacité de réactivation réduite. Ce biais fonctionnel et phénotypique a été confirmé en comparant la réponse immunitaire adaptative anti-adénovirus entre des souris déficientes en Fas et/ou P2X7R. Les réponses cellulaires et humorales sont moins importantes dans les souris B6/lpr P2X7KO que B6, B6-P2X7KO. Ces réponses antivirales sont intermédiaires dans les souris B6/lpr. L’ensemble de ces résultats renforcent notre hypothèse sur le rôle synergique des récepteurs Fas et P2X7R dans l’homéostasie des lymphocytes T. Le taux d’apoptose induit par l’activation des récepteurs Fas ou P2X7R séparément est moins important dans les lymphocytes T CD8+ par rapport au lymphocytes T CD4+. La synergie Fas-P2X7R serait donc nécessaire pour l’homéostasie des lymphocytes T CD8+. Afin de préciser les mécanismes à l’origine de la maladie et d’identifier l’influence de chaque récepteur sur l’expression des loci de susceptibilité, nous avons séquencé les ARNm exprimés dans la rate et les ganglions lymphatiques des souris MRL/lpr avant et après le développement de l’auto-immunité ainsi que chez les souris B6, B6/lpr, B6 P2X7KO et B6/lpr P2X7KO. / My project aims to determine the role of the purinergic receptor P2X7 (P2X7R) in the pathophysiological processes involved in the development of autoimmune lupus-like syndrome. MRL/lpr mice, deficient for the cell death receptor Fas (lpr mutation), spontaneously develop this pathology following the accumulation of pathogenic B220+CD4−CD8− (DN) T lymphocytes in secondary lymphoid organs. We have observed that these lymphocytes are also deficient in P2X7R cell surface expression. This led us to hypothesize that P2X7R could play a key role in T cell homeostasis and lupus development. To test our hypothesis, we produced B6 mice deficient for both Fas (lpr) and P2X7R (P2X7KO). These mice, but not single mutant B6 mice (lpr or P2X7KO), develop a massive accumulation of DN B220+ T lymphocytes and high levels of autoantibodies and proinflammatory cytokines, confirming for the first time the involvement of P2X7R in T-cell homeostasis. I have found that the pathogenic DN T lymphocytes are predominantly derived from the CD8+ T lymphocyte subpopulation. Chronic inflammation in B6/lpr P2X7KO mice induces the activation of the whole CD4+ and CD8+ naïve T lymphocyte subpopulations leading to the accumulation of Effector/Memory and exhausted T lymphocytes. Accumulated T-cells lose the ability to be reactivated. To confirm these results, I compared the adaptive immune response against adenovirus between mice deficient for Fas (lpr mutation), P2X7R-deficient mice or both receptors. The cellular and the humoral responses were lower in the B6/lpr-P2X7KO mouse strain compared to B6, B6-P2X7KO and B6/lpr mouse strains. The antiviral immune response in the B6/lpr mice was lower than in B6 and B6-P2X7KO mice. These results reinforce our hypothesis about the synergistic role of both receptors in the maintaining of T cell homeostasis. Ours results suggest that Fas and P2X7R play their synergistic role in T-cell homeostasis. In collaboration with a team from the University of Taiwan, we sequenced the mRNAs expressed in the spleen and lymph nodes of MRL/lpr mice before and after the onset of the diseases as well as in the B6, B6/lpr, B6 P2X7KO and B6/lpr P2X7KO mouse strains in order to better understand the mechanism triggering the disease and to identify the role of each receptor on the expression of the susceptibility loci.

Le récepteur-canal P2X7 est fortement exprimé et est fonctionnel dans la lignée de cellules cancéreuses mammaires humaines hautement invasives MDA-MB-435s. L’activation de P2X7 par l’ATP extracellulaire est responsable de l'émission des prolongements cellulaires et l'augmentation de la migration cellulaire. En outre, l’activation de P2X7 augmente l’invasion cellulaire à travers la matrice extracellulaire et fait intervenir la libération de forme mature de cathepsines à cystéine dans le milieu extracellulaire. L’inhibition pharmacologique de P2X7 diminue l’invasivité des cellules cancéreuses dans un modèle de micrométastases chez le poisson zèbre. Nous avons également montré que l’émodine (1,3,8-trihydroxy-6-méthylanthraquinone) une anthraquinone isolée de Rheum officinale Baill (Rhubarbe chinoise) inhibe l’invasivité des cellules cancéreuses humaines via l’antagonisme de P2X7 et n’as pas d’effet sur les autres récepteurs P2X. Nos résultats démontrent un nouveau mécanisme entre la fonctionnalité de P2X7 dans les cellules cancéreuses et l’invasivité cellulaire, un paramètre clé dans la croissance tumorale et le développement des métastases. Ceci suggère également un rôle thérapeutique potentiel pour les antagonistes des P2X7. / P2X7 receptor channel is highly expressed and fully functional in the highly invasive human breast cancer cell line MDA-MB-435s. Its activation by extracellular ATP is responsible for the extension of neurite-like cellular prolongations, and the increase in cell migration. Furthermore, P2X7 activation enhanced invasion through the extracellular matrix and was related to the increase of mature forms of cysteine cathepsins in the extracellular medium. Pharmacological targeting of P2X7 decreases cancer cell invasiveness in a zebrafish model of micrometastases. We also showed that emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone) an anthraquinone derivative originally isolated from Rheum officinale Baill (Chinese Rhubarb) inhibits human cancer cell invasiveness by specifically antagonizing the P2X7 and not the other members of the P2X family. Our results demonstrate a novel mechanistic link between P2X7 functionality in cancer cells and invasiveness, a key parameter in tumour growth and in the development of metastases. These results also suggest a potential therapeutic role for the newly developed P2X7 antagonists.

Le purinorécepteur P2X7 joue un rôle majeur dans les phénomènes de dégénérescences (Alzheimer, DMLA) et mort cellulaires. Récemment des études ont montré que l’activation basale de ce récepteur est indispensable dans le processus de cicatrisation et de prolifération cellulaire. Nous avons essayé de mieux comprendre le paradoxe de cette activation du récepteur P2X7 qui oriente vers la prolifération et même les métastases tumorales, mais aussi vers les mécanismes de dégénérescence cellulaire. L'influence du microenvironnement (Lipides, matrice extracellulaire, oxygène) apparait essentielle pour comprendre ces différents effets. Notre premier objectif a été d’étudier l’impact de la modulation du microenvironnement du récepteur P2X7 par des composants de la matrice extracellulaire. Ainsi, sur un modèle de cicatrisation cutanée, nous avons mis en évidence l’impact de la taille des fragments du hyaluronate de sodium (composant prédominant dans la matrice extracellulaire). Nos résultats ont montré que l’activation du récepteur P2X7 dépend du poids moléculaire du hyaluronate de sodium. Notre deuxième objectif a été de moduler le microenvironnement lipidique du récepteur P2X7. Nous avons sélectionné une huile riche en acides gras insaturés et avons ainsi étudié son effet sur l’activation du récepteur P2X7. Sur nos modèles de cicatrisation, nous avons mis en évidence qu’une modulation du microenvironnement lipidique du récepteur P2X7 influence son activation. D’autre part la modulation du microenvironnement lipidique sur des cellules tumorale de mélanome active les voies de dégénérescence ouvrant la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques. / The purinoceptor P2X7 plays a role in cytotoxic degenerative processus (Alzheimer, AMD) and cell death. Recent studies have shown that basal activation of this receptor is essential in the healing process and cell proliferation. We tried to understand the paradox that activation of P2X7 receptor that directs to the same proliferation and tumor metastasis, but also to the mechanisms of cell degeneration. The influence of the microenvironment (lipids, extracellular matrix, oxygen) appears essential to understand these effects. Our first objective was to study the impact of the modulation of P2X7 receptor microenvironment by extracellular matrix components. On cell monolayer model of wound healing we have highlighted the impact hyaluronan molecular weight (predominant component in the extracellular matrix). Our results showed that activation of P2X7 receptor is dependent on hyaluronan molecular weight. Our second objective was to modulate lipid microenvironment P2X7 receptor. We selected an oil rich in unsaturated fatty acids and thus have studied its effect on the activation of P2X7 receptor. In our models of healing and melanoma cell, we have demonstrated that modulation of lipid microenvironment affects P2X7 activation.

L’exposition prénatale à différents agents toxiques est généralement étudiée en considérant le placenta comme une barrière entre la mère et le fœtus ; nous le considérons en tant qu’organe cible des agents toxiques. Pour ce faire, nous avons sélectionné un modèle cellulaire de trophoblastes adapté aux études toxicologiques. En clinique, des pathologies de la grossesse sont associées à des modifications de la sécrétion de l’hormone placentaire lactogène hPL et de l’hormone gonadotrope chorionique hCG. Nos travaux in vitro ont permis de faire le lien entre une exposition à des micropolluants (le mono(2-ethylhexyl) phtalate, un perturbateur endocrinien, et le benzo(a)pyrene, un carcinogène) et ces observations cliniques. Les biomarqueurs de sécrétion hormonale (hPL et hCG hyperglycosylée) et de dégénérescence (activation du purinorécepteur P2X7) que nous avons identifiés permettent de détecter l’exposition et le risque suite à une exposition à des polluants. / Prenatal exposure to pollutants is commonly evaluated using placenta as a barrier between mother and fetus. Here, we consider placenta as a target organ for toxic agents. To achieve this, we selected a trophoblastic cell model, which is adapted to toxicological studies. In clinical studies, pregnancy pathologies are associated to changes in human placental lactogen (hPL) and human chorionic gonadotropin (hCG) secretions. Our in vitro work links exposure to micropollutants (mono(2-ethylhexyl)phthalate, an endocrine disruptor, and benzo(a)pyrene, a carcinogen) and clinical observations. We identified biomarkers of hormonal secretion (hPL and hyperglycosylated hCG) and degeneration (P2X7 receptor activation), which enable the evaluation of exposure and risk attached to exposure to pollutants.