Les récepteurs du glutamate de type kaïnate (KAR) jouent une grande variété de rôles dans la régulation de l’activité des réseaux neuronaux. Les KARs sont localisés à la fois dans les domaines pré- et postsynaptiques et sont impliqués dans différents rôles physiologiques tels que la libération de neurotransmetteur, le contrôle de l’excitabilité neuronale. ainsi que l’intégration et la plasticité synaptique (Pinheiro et Mulle 2006). Mon sujet de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans le trafic subcellulaire et de l'expression polarisée des récepteurs de type kaïnate contenant la sous-unité GluK3. J’ai d’abord essayé de trouver des protéines associées, cytoplasmiques, qui pourraient intervenir dans le trafic de ces récepteurs. Les approches de protéomique que j’ai utilisées n’ont pas donné de résultat. J’ai ensuite tenté de produire des anticorps dans le but de visualiser ces récepteurs dans le cerveau. Malheureusement, je n’ai pas obtenus d’anticorps suffisamment affins pour réaliser ce projet. Par des approches de mutagénése dirigée et d’expression des récepteurs recombinants dans des systèmes hétérologues ou dans des neurones d’hippocampe en culture, j’ai pu mettre en évidence que la sous-unité GluK3 est endocytée par la voie dépendante de la clathrine via un motif di-leucine cytoplasmique. L'endocytose des récepteurs est régulé par l'application d'acide kaïnique et permet une expression polarisée de GluK3b dans les dendrites. Nous avons ensuite développé un projet d'étude du trafic des récepteurs de type kaïnate hétéromériques composés des isoformes GluK3a et GluK3b. Ce projet est actuellement en cours, mais des données préliminaires semblent impliquer la sous-unité GluK3a dans le processus d'exocytose des récepteurs. Il est donc possible que l’association des deux isoformes serait nécessaire au contrôle de l'expression membranaire du récepteur (via GluK3a) et à l'adressage polarisé dans les neurones (via GluK3b). Cette hypothèse doit cependant être encore validée. / Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the brain. Glutamatergic synaptic transmission is mediated by three types of ionotropic receptors that have been classified according to their preferential affinity for the agonists NMDARs (N- methyl-D-aspartate receptors), AMPARs (a-amino-3-hydroxy- 5-methylisoazol-4- propionate receptors) and KARs (kainate receptors). Kainate receptors (KARs) are widely expressed in the brain and are present both at pre- and postsynaptic sites and are involved in several physiological functions. There are five subunits of KAR (GluR5-7, KA1 and KA2 or GluK1-5). One of the main project of my laboratory is to understand the function, the traffic and the regulation of GluK3 subunit, that has been involved in different neuronal desorders such as schizophrenia and depression. GluK3(GluR7)-containing KARs are thought to compose pre-synaptic autoreceptors that facilitate hippocampal mossy fiber synaptic transmission. There are two splice variants of GluK3, named GluK3a and GluK3b . GluK3a shares the same export motif as GluK2a in its C-terminal cytoplasmic domain which allows high expression at the plasma membrane in heterologous cell systems and in primary cultured neurons. In contrast, GluK3b seems to be retained in the endoplasmic reticulum (ER) and is only detected at the plasma membrane in substantial amounts when co-expressed with GluK3a. In my thesis, I have been interested in the mechanisms of polarized trafficking of GluK3 with a main focus on GluK3b. I have been able to identify molecular mechanisms that underlie the polarized trafficking of KARs composed of the GluK3b splice variant. Endocytosis followed by degradation is driven by a di-leucine motif on the cytoplasmic C-terminal domain of GluK3b both in heterologous cells and in cultured hippocampal neurons. The internalization of GluK3b is clathrin and Dynamin2 dependent. Moreover, endocytosis of GluK3b in neurons is regulated by bath application of the KAR agonist kainate. Interestingly, the preferential subcellular localization of GluK3b in dendrites or axons depends on the endocytotic process. We submitted a paper to J. of Neurosciences that show that the subcellular localization of GluK3b depends on the dynamic regulation of an endocytic process that could control the polarized trafficking of KARs in neurons in an activity- dependent manner. I also developped a second project focus on the traffic of KARs expressed as heteromers (GluK3b assembled with GluK3a). I am actually working on this project in my lab in order to send a second paper in the next months.

Les récepteurs de type kaïnate (rKA) appartiennent, avec les récepteurs de type NMDA (rNMDA) et les recepteurs de type AMPA (rAMPA), à la famille des récepteurs canaux glutamatergiques (iGluR). Les propriétés fonctionelles des rKA contenant la sous-unité GluK3 en font des récepteurs tout à fait singuliers. Une étude réalisée dans le laboratoire a montré que la faible sensibilité de ces récepteurs au glutamate est liée à une entrée très rapide dans l’état désensibilisé et que la fonction de ces récepteurs pourrait être amplifiée par des modulateurs endogènes.Parmi les modulateurs potentiels de la fonction des rKA pré-synaptiques, nous avons choisi d’étudier le zinc, en raison de sa concentration importante dans les vésicules des terminaisons des axones des cellules granulaires du gyrus denté (fibres moussues). En dépit du rôle proposé des rKA contenant la sous unité GluK3 dans la régulation pré-synaptique aux synapses MF-CA3, la modulation de ces récepteurs par le zinc n’a jamais été étudiée.Grâce à l’enregistrement électrophysiologique des courants GluK3 exprimés dans les cellules HEK-293, nous avons montré que le zinc facilite les courants des récepteurs contenant la sous-unité GluK3, activés par le glutamate. L’analyse des cinétiques, ainsi que la modélisation, montrent que l’effet facilitateur du zinc est dû à la réduction de l’entrée dans l’état désensibilisé des récepteurs GluK3. Grâce à la mutagénèse dirigée et l’étude cristallographique, nous avons pu déterminer le site de liaison du zinc, constitué de l’aspartate 759, de l’histidine 762 et de l’aspartate 730, et localisé dans l’interface de dimérisation du domaine de liaison de l’agoniste (LBD).Cette étude décrit pour la première fois un nouveau site de modulation positive de la fonction des rKA. / Glutamate released at excitatory synapses acts on ligand-gated ionotropic receptors which fall into three classes: NMDA, AMPA and kainate receptors.At hippocampal mossy fiber synapses onto CA3 pyramidal cells, KARs are present both at the pre- and postsynaptic levels. Postsynaptic KARs are composed of the GluK2, GluK4 and GluK5 subunits, whereas presynaptic KARs are thought to comprise the GluK2 and GluK3 subunits. The functional properties of GluK3 (and GluK2/GluK3) receptors set it apart from the other ionotropic glutamate receptors. In particular, its sensitivity to glutamate is the lowest of all known ionotropic glutamate receptors, due in large part to fast desensitization of receptors with one or two bound glutamate molecules. The low agonist sensitivity of this receptor raises questions about its relevance for synaptic function. Therefore, it is possible that endogenous modulators may potentiate its function.Among potential endogenous modulators of KAR function, we chose to address the role of zinc, because of the large amounts contained in mossy fiber terminals. Zinc is thought to be accumulated into synaptic vesicles, and is co-released with glutamate in the extracellular milieu during neuronal activity. Zinc has been reported to inhibit most of native and recombinant KARs. Despite the proposed role of at hippocampal mossy fiber synapses, although modulation of GluK3-containing KARs by zinc has not yet been addressed.In this study, we show that zinc greatly potentiates recombinant GluK3 receptor currents evoked by glutamate. Zinc markedly slows receptor desensitization and increases apparent affinity for glutamate. Crystallographic studies and analysis of chimeric GluK2/GluK3 KARs and of GluK3 bearing selected point mutations, allowed us to identify the zinc binding domain defined by D759, H762, Q756 and D730, and localized in a region forming the interface between two GluK3 subunits in an LBD dimer assembly. Based on these structure-function studies and on modeling of KAR activity, we show that zinc plays a very distinct role on GluK3-KARs by stabilizing the interaction between dimers of LBD thereby reducing desensitization.Given the proposed localization of GluK3 close to zinc containing synaptic vesicles, zinc may be an endogenous allosteric modulator for native GluK3-KARs, and its binding site a new pharmacological target.