L’infection primaire par le cytomégalovirus (CMV) humain est asymptomatique. Le sujet infecté reste cependant porteur du virus à l’état latent. Le CMV ne se réactive que sporadiquement chez l’individu immunocompétent. Chez les patients immunodéprimés, la réactivation du CMV peut induire des maladies à CMV touchant des organes vitaux et peut mettre en jeu le pronostic vital du patient. Les traitements standards sont efficaces mais leurs effets secondaires et l’apparition de souches virales résistantes relancent l’engouement pour le développement de nouvelles thérapies. Lors de ma thèse, j’ai utilisé le système CRISPR/Cas9 afin de déstabiliser le génome du CMV. Nous avons choisi de cibler le gène UL122/UL123 codant pour les molécules immediate early essentielles au cycle lytique réplicatif et à la sortie de la latence. Nous avons comparé deux stratégies utilisant soit un soit trois gRNAs, respectivement appelées singleplex et multiplex ciblant ce même gène. Alors que le singleplex induit des insertions et délétions au site de coupure du gRNA, la stratégie multiplex induit la délétion de 3500 paires de bases du gène ciblé. De ce fait, la stratégie multiplex bloque efficacement l’expression du gène ciblé, la réplication virale et le relargage de nouveaux virions. Une autre stratégie a été développée pour cibler spécifiquement le génome à l’état latent. Les deux régions homologues TR et le gène LUNA sont ciblés par deux gRNAs. Cette seconde stratégie résulte elle aussi en une diminution du nombre de copies de génome viral lors du cycle lytique de réplication. Il est désormais possible d’envisager de nouvelles solutions thérapeutiques anti-HCMV avec la stratégie CRISPR/Cas9. / The human cytomegalovirus (HCMV) primary infection is usually asymptomatic but leads to latent infection of blood progenitor cells. Immunocompromised patients are at high risks of HCMV reactivation, which is associated with severe end organ diseases and increased mortality in transplant patients. Standard anti-viral treatments based on nucleotide analogues decreased the occurrence of HCMV reactivation and diseases, but induce side effects and drug-resistant viral strains. In this thesis, we introduced new anti-viral approaches based on the CRISPR/Cas9 gene editing tool. Two strategies are designed to target the UL122/123 gene of HCMV encoding the immediate early proteins, essential for lytic viral replication and reactivation from latency. We validated that the disruption of the UL122/123 gene by the CRISPR/Cas9 system to abrogate viral replication. The multiplex CRISPR/Cas9 system (three gRNA) was much more efficient than the singleplex approach targeting the same gene. Target gene expression, concomitant genome replication and virion release were significantly impaired by the multiplex strategy. A further anti-HCMV CRISPR/Cas9 system was developed specifically to target the HCMV genome during latency. Two gRNAs target the viral genome at three target sites: LUNA, essential for reactivation, and the two homolog TR regions. We verified this duplex strategy on the lytic replicating virus and detected mutations at the target site as well as the reduction of viral genome copy number. In conclusion, the anti-HCMV strategies based on two or three gRNAs efficiently blocked viral replication. This provides the basis for the development of an anti-HCMV CRISPR/Cas9 therapy.