Les cellules utilisent deux stratégies principales pour réparer les cassures double-brin (CDB) de l’ADN : la recombinaison homologue (RH) et la ligature d’extrémités non homologues (NHEJ). D’autres voies de réparation plus minoritaires existent qui mènent nécessairement à des altérations génétiques : Single Strand Annealing (SSA) et Alternative End Joining (A-EJ). Nous avons proposé que le choix entre les mécanismes de réparation des CDB nécessite deux étapes : 1) la compétition entre C-NHEJ et la résection, 2) sur les extrémités d’ADN résectées, la compétition entre RH, A-EJ et SSA. Ici, nous avons étudié la régulation de la deuxième étape de ce choix. En outre, la létalité synthétique a été décrite entre RAD52 et BRCA2/PALB2. Étant donné que BRCA2 et PALB2 sont nécessaires pour le chargement de RAD51 sur l’ADN simple brin, cela suggère que la formation d’un nucléofilament RAD51/ADNsb ordonné et RAD52 sont des acteurs essentiels dans le choix de la réparation à la deuxième étape. Nous avons trouvé que l’extinction de RAD51 ou BRCA2 stimule à la fois le SSA et EJ, d’une manière épistatique et que RAD52 contrôle la stimulation de SSA et A-EJ, en absence de RAD51. De plus, par séquençage haut débit, nous montrons que l’inhibition de RAD51 induit une instabilité génomique médiée par la microhomologie au niveau du génome. Cependant l’inhibition de RH n’est pas la réparation directe suffisante vers SSA et A-EJ. En effet, en utilisant des mutants dominants négatifs de RAD51, nous avons trouvé que les mutants du site de fixation/hydrolyse de l’ATP inhibent la RH et stimulent le SSA et que la chimère SMRAD51, qui inhibe la RH, inhibe également le SSA et EJ. Par TEM, nous avons observé que SMRAD51 perturbe spécifiquement la structure de l’ADNsb/SMRAD51. De l’autre côté, deux mutants d’hydrolyse de l’ATP de RAD51 ont montré que la liaison à l’ATP et l’hydrolyse d’ATP sont nécessaires pour une charge efficace de RAD51 sur l’ADN endommagé, dans les cellules vivantes. Ces deux mutants d’ATP ne se fixent pas à l’ADN en opposition à SMRAD51. Enfin, nous montrons que RAD51 n’empêche pas la résection étendue, mais que, in vitro, la protéine RAD51 empêche l’annealing de l’ADNsb complémentaire. Au total, les données montrent que RAD51 joue effectivement un rôle crucial dans la deuxième étape du choix de la voie de réparation des CDB à travers deux mécanismes distincts : 1- il déclenche la RH par son activité catalytique, 2- mail il empêche également les mécanismes non conservateurs dépendants de RAD52, SSA et A-EJ, en altérant l’étape de l’annealing. Par conséquent, le choix en deuxième étape entre la RH et les mécanismes mutagènes, SSA et A-EJ, est orchestré par un antagonisme entre RAD51 et RAD52. / Cells use two primary strategies to repair DNA double-strand break (DSB): Homologous Recombination (HR) and Non-homologous end joining (NHEJ). Beside other mechanisms exist that necessarily lead to genetic alterations: Single Strand Annealing (SSA) and Alternative End Joining (A-EJ). We have proposed that the choice between DSB repair mechanisms requires two steps: 1) competition between C-NHEJ and resection; 2) on resected DNA ends, competition between HR, A-EJ and SSA. Herein we investigated the regulation of the second step of this choice. Furthermore, synthetic lethality has been described between RAD52 and BRCA2/PALB2. Since BRCA2/PALB2 are required for the loading of RAD51 onto the ssDNA, suggesting that both the formation of an ordered RAD51/ssDNA nucleofilament and RAD52 are central players in the choice of repair at the 2nd step.We found that silencing RAD51 or BRCA2 stimulate both SSA and EJ, in an epistatic manner and that silencing RAD51 induced microhomology mediated genomic instability at a genome wide level. Moreover, we show that RAD52 controls the stimulation of SSA and A-EJ, upon RAD51 silencing. However inhibition of HR is not sufficient redirect repair toward SSA and A-EJ. Indeed, using dominant negative mutants of RAD51 we found that the chimera SMRAD51, which inhibits HR, also inhibits SSA and EJ. By TEM we observed that SMRAD51 specifically disrupts the structure of the ssDNA/SMRAD51. On the other side, two ATP hydrolysis mutants of RAD51 showed that ATP binding and hydrolysis is required for efficient loading of RAD51 on damaged DNA, in living cells. These two ATP mutants that do not bind DNA in opposition to SMRAD51, do not inhibit A-EJ and stimulate SSA. Finally we show RAD51 do not prevents extended resection, but that, in vitro, RAD51 protein prevents the annealing of complementary ssDNA.Altogether the data show that RAD51 indeed plays a pivotal role in the second step of DSB repair pathway choice through two separable mechanisms: 1- it triggers HR through its catalytic HR activity 2- but it also prevents RAD52-dependent non-conservative mechanisms SSA and A-EJ, by impairing the annealing step. Therefore, the choice between HR and alternative mutagenic mechanisms A-EJ and SSA (2nd step) is orchestrated by an antagonism between RAD51 and RAD52

Chez les mammifères, la réparation des CDBs par la voie NHEJ (Non Homologous End Joining) implique plusieurs complexes multi-protéines : (i) de reconnaissance (ADN-Ku70/Ku80), (ii) de maturation et (iii) de ligation comprenant XRCC4, XLF et ligase IV. Si les protéines impliquées dans le NHEJ sont connues, leurs propriétés structurales et fonctionnelles le sont moins. Au cours de ma thèse, j’ai combiné des approches biochimiques, de Microscopies Electronique et à Force Atomique, pour caractériser les propriétés de XRCC4, de XLF et leurs interactions avec le complexe de reconnaissance en particulier Ku. J’ai montré que la protéine complète XRCC4 est capable de polymériser et former des filaments alors qu’elle ne peut pas en faire en absence de la région C-terminale. Par Microscopies Electronique et à Force Atomique; nous avons montré que le filament XRCC4 forme une structure hélicoidale de chiralité gauche. XLF seule ne forme pas de filament mais peut être incorporé dans le filament XRCC4, ce que nous avons montré par immunomarquage. L’analyse d’images réalisé en collaboration et avec l’algorithme d’Edward Egelman (Université de Virginie-USA) a permis d’obtenir une reconstruction 3 D du filament XRCC4. Il est composé de 2 filaments enroulés l’un autour de l'autre avec un pas de 54 nm. Des Etudes sont en cours afin d’obtenir une structure 3D en CryoEM à haute résolution. L’étude des propriétés physicochimiques de l’assemblage du filament en fonction de la concentration, la température et le temps d’incubation a permis de montrer la dynamique du filament avec une stabilisation à basse température, et une concentration située entre 50 et 250 nM. L’ADN avec ou sans extrémités interagit avec les filaments. Cette interaction stabilise et promeut l’extension du filament. L’incorporation de XLF stabilise aussi le filament XRCC4. L’analyse des complexes formés entre l’ADN et XRCC4 ou XLF à l’état oligomérique montre des événements de pontage intra ou intermoléculaires. Parallèlement, nous avons étudié les propriétés de reconnaissance de l’ADN par l’hétérodimère Ku70/Ku80 et avons montré que le domaine KBM de XLF interagit avec Ku80 au sein de l’hétérodimère. En conclusion, nous montrons que le filament XRCC4 pourrait jouer un rôle d’architecture en maintenant les extrémités physiquement proches. Le recrutement de XLF dans le filament XRCC4 permettrait d’assembler le complexe de ligation avec le complexe de reconnaissance grâce aux interactions entre Ku et XLF. / In mammals, DSBs repair by the Non Homologous End Joining (NHEJ) pathway involves several multi-protein complexes : (i) the recognition complex (the Ku70 / Ku80 heterodimer), (ii) the maturation complex and (iii) the ligation complex comprising XRCC4, XLF, PAXX and ligase IV. If the proteins involved in NHEJ are identified and characterized, their structural and functional properties are often poorly understood. During my thesis I combined biochemical approaches, and molecular microscopies (Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy), to characterize the properties of XRCC4, XLF and their interactions with the recognition complex (Ku-DNA). I have shown that the full length XRCC4 forms oligomers in solution (dimers and tetramers) and it polymerize into filaments whereas it can’t do it when the C-terminal region is absent. We initially characterized the structure of this filament in Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy. XRCC4 filament forms a helicoidal structure of left chirality. XLF alone does not forms a filament but can be incorporated into the XRCC4 filament, which we have shown by immunostaining with gold beads. In collaboration with Edward Egelman (University of Virginia-USA), the image analysis performed using his algorithm allowed us to obtain a 3D reconstruction of the XRCC4 filament. It consists of 2 filaments wound around each other in a helical manner with a pitch of 54 nm. Studies in CryoEM are in progress to obtain a 3D high resolution structure. The study of the physicochemical properties of the filament assembly as a function of the concentration, the temperature and the incubation time allowed to show the dynamics of the filament with stabilization at low temperature, and a concentration between 50 and 250 nM. DNA with or without ends interacts with the filaments. This interaction stabilizes and promotes the extension of the filament. Similarly, incorporation of XLF stabilizes the Xrcc4 filament. Analysis of complexes formed between DNA and XRCC4 or XLF in the oligomeric state shows intra- or intermolecular bridging events. In parallel, we have studied the DNA recognition properties of the Ku70/Ku80 heterodimer and we have shown that KBM domain of XLF interacts with Ku80 within the heterodimer. In conclusion, we show that the XRCC4 filament could play an architectural role favoring repair events by keeping the ends physically close. The recruitment of XLF into XRCC4 filaments ans its interaction with Ku allow the link between ligation and recognition complexes.