Les β-arrestines jouent un rôle important dans la transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous montrons dans cette thèse que les β-arrestines exercent des régulations plus complexes et subtiles qu'on ne le pensait jusque-là sur la voie AMPc/PKA/CREB qui est activée par les RCPGs couplés à Gs. Nous montrons que les β-arrestines interagissent directement la PKAcat et contribuent à sa translocation nucléaire. De plus, nous mettons en évidence une interaction β-arrestine/CREB qui conduit à la formation d'un complexe transcriptionnellement actif sous l’action de l’agoniste. D’autre part, nous avons constaté que les β-arrestines interagissent directement avec PKAcat, p70S6K et Src via un même site et lesquelles sont donc potentiellement mutuellement exclusives. Nous avons ensuite mesuré l’impact d’une mutation et d’un polymorphisme du R-FSH sur la signalisation dépendante des β-arrestines, notamment grâce à l’utilisation de senseurs FRET et BRET. / Β-arrestins play an important role in G protein-coupled receptor (GPCR)-induced signal transduction. In this thesis, we show here that β-arrestins exert more complex and subtle regulation than previously thought on the cAMP/PKA/CREB pathway which is activated by Gs-coupled GPCRs. We demonstrate that β-arrestins directly interact with PKAcat and promote its translocation to the nucleus. Moreover, we provide evidence that β-arrestins directly interact with CREB thereby forming a transcriptionally active complex upon agonist stimulation. We also found that PKAcat, p70S6K and Src all directly interact with β-arrestins through the same interaction site and are therefore potential mutually exclusive interactions. We then measured the impact of a point mutation and of a polymorphism in the FSH-R on β-arrestin-dependent signaling, in part using FRET and BRET sensors.

Appartenant à la sous-famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) apparentés àla rhodopsine et identifiés comme des cibles à fort potentiel thérapeutique, les récepteurs MT, et MT2à la mélatonine, 5-HT2C à la sérotonine et CB2 aux cannabinoïdes ont été étudiés par des approches insilico afin de mettre en évidence les déterminants structuraux critiques pour l'affinité, la sélectivité etl'activité pharmacologique de leurs ligands. Bénéficiant de données cristallographiques récentes,plusieurs états conformationnels de ces quatre récepteurs ont été modélisés en fonction du profilpharmacologique recherché. L'étude comparative de ces différents états conformationnels par dessimulations de dynamique moléculaire a permis de caractériser le rôle prépondérant joué par la boucleextracellulaire E2 et l'hélice 6 dans les mécanismes d'activation de ces RCPGs. Sur la base deméthodes chémoinformatiques, le criblage virtuel de ligands ciblant ces modèles tridimensionnels apermis de caractériser un modèle du récepteur 5-HT2C très spécifique de ligands agonistes inverses etd'identifier des touches pharmacologiques sur les récepteurs MTi et CB2. / Identified as highly relevant therapeutical targets, the MT, and MT2 melatonin receptors, the5-HT2C serotonin and the CB2 cannabinoid receptors, which belong to the rhodopsin-like G proteincoupledreceptors (GPCRs) subfamily, have been studied by in silico approaches in order to identifycritical structural features for the binding, the selectivity and the pharmacological activity of theirligands. Gaining by sottie recent crystallographic data, various conformational states of these fourreceptors have been modeled according to the expected pharmacological profile. The comparativestudy of these various conformational states by molecular dynamics simulations has led to emphasizethe crucial rôle of the E2 extracellular loop and hélix 6 in the activation mechanisms of these GPCRs.On the basis of chemoinformatic methods, the virtual ligand screening targeting these threedimensionalmodels has promoted the characterization of a 5-HT2C receptor model able to bindspecifically inverse agonist ligands and the identification of pharmacological hits targeting the MTiand CB2 receptors.

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs. / GABA is the principal inhibitory neurotransmitter in the CNS and is implicated in brain development, synaptic plasticity and the pathogenesis of diseases such as epilepsy, anxiety disorders and chronic pain. In the current model of GABA-B function, there is a requirement for GABA-B1/B2 dimerization for targetting to the cell surface and effector coupling. However, there are certain brain regions (putamen), cell types (glial cells) and times during brain development where GABA-B1 is expressed in higher amounts than GABA-B2, suggesting that GABA-B1 might be functional alone or in association with unidentified partners, either at the cell surface or on the ER membranes. In this thesis, we first show the capacity of endogenous GABA-B1 receptors to activate the MAPK-ERK1/2 pathway in the DI-TNC1 glial-derived cell line which does not express GABA-B2. The underlying mechanisms remain incompletely defined but depend on Gi/o and PKC. Immunohistochemistry of endogenous receptors shows that GABA-B1 N-terminal antibodies recognize ER-localized proteins and that C-terminal (CT) antibody shows intranuclear distribution. This data suggests that fragments of the GABA-B1 receptor are generated by proteolysis and indeed we show that agonist treatment affects the intensity of certain C-terminal GABA-B1 fragments both in immunohistochemistry and western blots suggesting that the GABA-B1 receptor is subjected to regulated proteolysis. Since a 13-residue potential PEST sequence was localized immediately distal to the ER retention motif in the GABA-B1 CT, we examined proteasome regulation of the cleavage event. Following a 12h treatment with the proteasome inhibitor, epoxomicin, we detected increases in intranuclear staining for both GABA-B1 and a known interactor, the pro-survival transcription factor ATF-4, using confocal microscopy and by western blotting of nuclear extracts. These increases are due either to proteasome inhibition or activation of the ER stress pathway. In cells overexpressing GABA-B1-CT, ATF-4 induction and nuclear translocation, which normally follows epoxomicin treatment, was completely abolished. This observation was associated to a strong decrease in cell number. Since the last three residues of GABA-B1-CT (LYK) encode a pseudo-PDZ ligand and that PDZ domain protein regulate nuclear targeting and protein stability, in complement to their role in scaffolding at the cell surface, we mutated the last three residues of GABA-B1-CT to alanines. This mutation completely reversed the effect of GABA-B1-CT on ATF-4 induction and on cell number. This second set of data suggests the existence of agonist and proteasome-regulated intranuclear GABA-B1 fragments in DI-TNC1 cells. Further, the GABA-B1-CT pseudo-PDZ ligand appears to be critically important in regulating ATF-4 induction by modulating GABA-B1-CT stability and perhaps by favoring the formation of a multiprotein complex with ATF-4, ATF-4 interactors and an unknown scaffolding protein. Overall, we show that ER-localised GABA-B1 subunits, when not dimerized with GABA-B2, can still modulate proliferation, differentiation and survival pathways, both through G-protein coupling and regulated proteolysis. The signalling mechanisms which we propose could serve as a new platform in understanding the long term effects of 7-TM receptor activation.

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs. / GABA is the principal inhibitory neurotransmitter in the CNS and is implicated in brain development, synaptic plasticity and the pathogenesis of diseases such as epilepsy, anxiety disorders and chronic pain. In the current model of GABA-B function, there is a requirement for GABA-B1/B2 dimerization for targetting to the cell surface and effector coupling. However, there are certain brain regions (putamen), cell types (glial cells) and times during brain development where GABA-B1 is expressed in higher amounts than GABA-B2, suggesting that GABA-B1 might be functional alone or in association with unidentified partners, either at the cell surface or on the ER membranes. In this thesis, we first show the capacity of endogenous GABA-B1 receptors to activate the MAPK-ERK1/2 pathway in the DI-TNC1 glial-derived cell line which does not express GABA-B2. The underlying mechanisms remain incompletely defined but depend on Gi/o and PKC. Immunohistochemistry of endogenous receptors shows that GABA-B1 N-terminal antibodies recognize ER-localized proteins and that C-terminal (CT) antibody shows intranuclear distribution. This data suggests that fragments of the GABA-B1 receptor are generated by proteolysis and indeed we show that agonist treatment affects the intensity of certain C-terminal GABA-B1 fragments both in immunohistochemistry and western blots suggesting that the GABA-B1 receptor is subjected to regulated proteolysis. Since a 13-residue potential PEST sequence was localized immediately distal to the ER retention motif in the GABA-B1 CT, we examined proteasome regulation of the cleavage event. Following a 12h treatment with the proteasome inhibitor, epoxomicin, we detected increases in intranuclear staining for both GABA-B1 and a known interactor, the pro-survival transcription factor ATF-4, using confocal microscopy and by western blotting of nuclear extracts. These increases are due either to proteasome inhibition or activation of the ER stress pathway. In cells overexpressing GABA-B1-CT, ATF-4 induction and nuclear translocation, which normally follows epoxomicin treatment, was completely abolished. This observation was associated to a strong decrease in cell number. Since the last three residues of GABA-B1-CT (LYK) encode a pseudo-PDZ ligand and that PDZ domain protein regulate nuclear targeting and protein stability, in complement to their role in scaffolding at the cell surface, we mutated the last three residues of GABA-B1-CT to alanines. This mutation completely reversed the effect of GABA-B1-CT on ATF-4 induction and on cell number. This second set of data suggests the existence of agonist and proteasome-regulated intranuclear GABA-B1 fragments in DI-TNC1 cells. Further, the GABA-B1-CT pseudo-PDZ ligand appears to be critically important in regulating ATF-4 induction by modulating GABA-B1-CT stability and perhaps by favoring the formation of a multiprotein complex with ATF-4, ATF-4 interactors and an unknown scaffolding protein. Overall, we show that ER-localised GABA-B1 subunits, when not dimerized with GABA-B2, can still modulate proliferation, differentiation and survival pathways, both through G-protein coupling and regulated proteolysis. The signalling mechanisms which we propose could serve as a new platform in understanding the long term effects of 7-TM receptor activation.

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Les Récepteurs Couplés aux Protéines-G forment la plus importante famille de protéines membranaires chez l’homme et sont impliqués dans de nombreux processus de signalisation cellulaire. Aussi, ils forment un vivier très important de cibles thérapeutiques, déjà identifiées ou potentielles. L’activation d’un RCPG est amorcée par la liaison d’un ligand dans sa partie extra-cellulaire, modifiant ainsi ses propriétés dynamiques intrinsèques. Ces changements structuraux vont alors se répercuter le long des domaines trans-membranaires et promouvoir la dissociation de la Protéine-G hétéro-trimérique, de l’autre côté de la membrane, propageant ainsi le signal au compartiment intra-cellulaire. Ce processus peut être modulé par la liaison de nombreux autres partenaires des RCPGs. Malgré de nombreuses données structurales existantes, ces mécanismes restent encore mal connus à l’échelle moléculaire. Ainsi, la dynamique moléculaire s’est révélée être un outil formidable pour mieux comprendre ces mécanismes. Toutefois, les échelles de taille et de temps requises pour discuter de la dynamique de ces systèmes membranaires limitent ces études aux laboratoires ayant accès à une très grande puissance de calcul. L’objectif des travaux présentés dans ce manuscrit a été de prédire et de mieux comprendre la dynamique d’interaction de différents récepteurs de cette famille avec leurs partenaires, en développant un protocole de dynamique moléculaire, peu coûteux en ressources de calcul, combinant le champ de forces gros-grains MARTINI à un protocole de dynamique moléculaire « Replica-Exchange ».Dans un premier temps, nous présentons la validation de notre protocole pour la prédiction de la liaison de peptides à leur récepteur avec l’étude des peptides Neurotensine, agoniste du Récepteur de la Neurotensine-1, et CVX15, antagoniste du Récepteur Chemokine C-X-C de type-4. Nous montrons également que notre protocole est capable de prédire la sélectivité de plusieurs peptides dérivés de la Neurotensine envers plusieurs récepteurs sauvages et mutés, ne présentant qu’un résidu de différence.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la dynamique de formation d’un hétéro-dimère de RCPGs impliquant le Récepteur de la Ghréline et le récepteur de la Dopamine D2, couplés aux protéines Gq et Gi respectivement. Ce modèle validé au laboratoire par des mesures LRET montre une interface impliquant une forte complémentarité entre les protéines-G. En se basant sur notre modèle, nous avons conçu et synthétisé des peptides inhibiteurs de la formation de cet hétéro-dimère de protéines-G.Enfin, nous présentons d’autres exemples d’applications de notre protocole et comment il peut être utilisé de concert avec l’expérience avec : la prédiction de la liaison de toxines de serpents aux Récepteurs de la Vasopressine-1a et V2 ; la prédiction de la liaison des peptides Ghréline et Leap2 au Récepteur GHSR-1a et la prédiction de la sélectivité de couplage de différents récepteurs aux peptides C-terminaux de la sous-unité α des protéines-G. / G-Protein Coupled Receptors form the largest family of human membrane proteins and are involved in many cellular signaling processes. Thus, they constitute a pool of already identified or potential pharmacological targets. The activation of a GPCR starts with the binding of a ligand in its extra-cellular part, further modifying its intrinsic dynamical properties. These structural rearrangements are then transmitted along the transmembrane domains and promote the dissociation of the G-protein on the other side of the bilayer, thus propagating the signal into the intra-cellular compartment. This activation process can be modulated by the binding of many other partners of GPCRs. Despite many structural data now available, these mechanisms are still badly known at the molecular scale. In agreement, molecular dynamics simulations appear to be a method of choice to get a better description of these mechanisms. Nevertheless, the size and the time scales required for the simulation of these membrane systems limit such studies to laboratories having access to large computational facilities.The objective of this work was to predict and get a dynamical view of the interactions of several GPCRs with their partners, by developing an affordable molecular dynamics protocol that combines the coarse-grained MARTINI force field to Replica-Exchange MD simulations.In a first step, we validated our protocol by showing its ability to predict the dynamical binding of peptides to their receptors, through the study of Neurotensin, an agonist of the Neurotensin-1 receptor and CVX15, an antagonist of the CXCR4 chemokine receptor. We also show that the same protocol is able to predict the selectivity of several Neurotensin derived peptides against several wild-type/mutated receptors differing by a single residue.In a second step, we were concerned by the dynamical assembly of a GPCR heterodimer involving the Ghrelin and the Dopamine D2 receptors, respectively coupled to Gq and Gi proteins. Our model was validated by LRET measurements confirming a large protein:protein interface and a high complementarity between G-proteins. Based on this model, we designed and synthesized some peptides able to inhibit the assembly of this G-proteins heterodimer.Finally, we describe other applications of our protocol and how it can be employed and confronted to experiments to : predict the dynamical binding of toxins from snake’s venom to the Vasopressin-1a and Vasopressin-2 receptors ; predict the binding of the Ghrelin and Leap2 peptides to their GHSR-1a receptor and predict the coupling selectivity of several receptors to peptides mimicking the C-terminus of the α subunit of G-proteins.