Novas abordagens terapêuticas vêm sendo introduzidas para doenças musculares genéticas como distrofias musculares e miopatias congênitas, distúrbios que permanecem sem cura até o momento. Estes recentes avanços motivaram um interesse renovado e crescente por métodos não invasivos para a caracterização e monitoramento do músculo afetado, particularmente durante e após intervenções terapêuticas. Neste contexto, modelos animais são essenciais para uma melhor compreensão dos mecanismos das doenças e para testar novas terapias. Recentemente, avanços significativos na avaliação não invasiva de modelos murinos para doenças musculares genéticas foram alcançados. Entretanto, diversas linhagens de camundongos ainda não foram caracterizadas de maneira não invasiva, e ainda é necessário o desenvolvimento de métodos sensíveis para a identificação precoce de alterações sutis no músculo de camundongos afetados. A proposta desta tese é aplicar técnicas não invasivas inovadoras no estudo do músculo de modelos murinos para doenças musculares genéticas com fenótipos variados. Três modelos murinos para distrofias musculares (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) e um modelo murino para miopatia congênita (KI-Dnm2R465W) foram estudados com métodos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Duas linhagens distróficas (Largemyd, mdx/ Largemyd) e camundongos normais após injúria foram estudados através de micro-Tomografia Computadorizada (micro-CT). Em RMN, todas as linhagens de camundongos afetados apresentaram aumento de T2 muscular, o que foi relacionado a diversas anomalias na análise histológica, como necrose e inflamação, mas também a conjuntos de fibras em regeneração ou a fibras com citoarquitetura alterada. A combinação de RMN com análise de textura permitiu a identificação não ambígua de todas as linhagens distróficas, sendo que apenas a comparação dos valores de T2 muscular não permitiu esta diferenciação. Camundongos mdx mostraram alterações funcionais e morfológicas na rede vascular do músculo. Estudo piloto em camundongos KI-Dnm2R465W revelou tendências de comprometimento da função muscular. Por fim, imagens de micro-CT não permitiram a detecção de diferenças na composição muscular em camundongos distróficos. Este conjunto de resultados não apenas enriquece o painel de modelos murinos para doenças musculares genéticas caracterizados de maneira não invasiva, mas também demonstra um certo grau de especificidade nas anomalias observadas nas imagens, como revelado pela análise de textura. Estes resultados também mostraram que métodos não invasivos de RMN podem ser suficientemente sensíveis para identificar alterações sutis no fenótipo muscular murino, mesmo em estágios precoces. Esta tese foi desenvolvida sob acordo de co-tutela internacional entre a França e o Brasil, e compreendeu uma importante transferência de conhecimento, com os primeiros estudos não invasivos de músculo murino realizados no Brasil. / Novel therapeutic approaches are being introduced for genetic muscle diseases such as muscle dystrophies and congenital myopathies, all of them having remained without cure so far. These recent developments have motivated a renewed and augmented interest in non-invasive methods for muscle characterization and monitoring, particularly during and after therapeutic intervention. In this context, animal models are essential to better understand the disease mechanisms and to test new therapies. Recently, significant advances in the non-invasive evaluation of mouse models for genetic muscle diseases have been achieved. Nevertheless, there were still several mouse strains not characterized non-invasively, and it was necessary to develop sensitive methods to identify subtle alterations in the murine affected muscle. The purpose of this thesis was to apply non-invasive techniques in the study of murine models for genetic muscle diseases with variable phenotypes. Three mouse models for muscle dystrophy (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) and one mouse model for congenital myopathy (KI-Dnm2R465W) were studied with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) methods. Two dystrophic strains (Largemyd, mdx/ Largemyd) and normal mice after injury were studied through micro-Computed Tomography (micro-CT). On NMR, all affected mouse strains presented increased muscle T2, which could be related to variable features in the histological evaluation, including necrosis and inflammation, but also to clusters of fibers under regeneration or with altered cytoarchitecture. The combination of NMR and texture analyses allowed the unambiguous differential identification of all the dystrophic strains, although it was not feasible when comparing the muscle T2 measurements only. Mdx mice showed functional and morphological alterations of vascular network. In the KI-Dnm2R465W mice, a pilot study revealed tendencies of functional impairment. Finally, micro-CT images were unable to detect differences in muscle´s content in dystrophic mice. Altogether, these results not only increased the number of murine models for genetic muscle diseases non-invasively characterized, it also demonstrated some degree of specificity of the imaging anomalies, as revealed by texture analysis. It also showed that non-invasive NMR methods can be sensitive enough to identify subtle alterations in murine muscle phenotype, even in early stages. This thesis was developed under an international joint supervision between France and Brazil, and comprised an important transfer of technology, with the first non-invasive studies of murine muscles performed in Brazil.

Submitted by Kamila Costa (kamilavasconceloscosta@gmail.com) on 2015-08-25T12:30:42Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge R de Carvalho.pdf: 2065994 bytes, checksum: 0655865aeaa306321c7e581b5e183859 (MD5) Capa.pdf: 361187 bytes, checksum: 984971f09c5fc93637a7df2858604a5b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-08-26T19:00:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge R de Carvalho.pdf: 2065994 bytes, checksum: 0655865aeaa306321c7e581b5e183859 (MD5) Capa.pdf: 361187 bytes, checksum: 984971f09c5fc93637a7df2858604a5b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-08-26T19:03:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge R de Carvalho.pdf: 2065994 bytes, checksum: 0655865aeaa306321c7e581b5e183859 (MD5) Capa.pdf: 361187 bytes, checksum: 984971f09c5fc93637a7df2858604a5b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-26T19:03:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge R de Carvalho.pdf: 2065994 bytes, checksum: 0655865aeaa306321c7e581b5e183859 (MD5) Capa.pdf: 361187 bytes, checksum: 984971f09c5fc93637a7df2858604a5b (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / High-level Density Functional Theory (DFT) calculations have been performed to study the effect of the hydrogen bond formation on the nuclear magnetic resonance (NMR) parameters of clusters of glycine molecules in gas-phase. Clusters containing up to four glycine molecules besides the isolated glycine have been considered for the present work. DFT predicted isotropic chemical shifts of H, C, N and O of the isolated glycine with respect to standard reference materials are in reasonable agreement with available experimental data. The variations of isotropic and anisotropic chemical shifts for all atoms constituting these clusters containing up to four glycine molecules have been investigated systematically employing gradient corrected hybrid B3LYP functional with three different types of extended basis set : 6-31++G(2d,2p) of Pople, aug-cc-pVDZ of Dunning and aug-pc1 of Jensen. All three models show very consistent results. The glycine clusters are mainly stabilized by a network of hydrogen bond formation among the carboxylic (COOH) groups of glycine monomers. The formation of hydrogen bonds influences significantly the molecular structure of the clusters which, on the other hand, gets reflected in the variation of NMR properties. The bridging hydrogen (H) of the proton-donor O-H bond, the carbon (C) atom of the –COOH group and the oxygen (O) atom of the proton-acceptor C=O bond suffer downfield shift due to formation of hydrogen bond. The length of hydrogen bond formed between the glycine monomers and the complexity of the structure are found to vary with the number of monomers present in the cluster. A direct correlation between the hydrogen bond length and isotropic chemical shift of the bridging hydrogen is observed in all cases. / A Teoria do Funcional da Densidade (DFT) foi utilizada para estudar o efeito da formação das ligações de hidrogênios nos parâmetros ressonância magnética nuclear (RMN) dos agregados das moléculas da glicina em fase gasosa. Agregados contendo até quatro moléculas da glicina, além da glicina isolada, foram considerados para o presente trabalho. Os deslocamentos químicos isotrópicos de H, C, N e O da glicina isolada com relação aos materiais de referência padrão, calculados com base na DFT, estão razoavelmente de acordo com os dados experimentais disponíveis. As variações dos deslocamentos químicos isotrópicos e anisotrópicos para todos os átomos que constituem estes agregados foram investigados sistematicamente empregando o funcional híbrido, B3LYP junto com três diferentes tipos de conjunto de base: (i) 6-31++G(2d, 2p) de Pople; (ii) aug-cc-pVDZ de Dunning; e (iii) aug-pc1 de Jensen. Todos os três modelos mostram resultados muito consistentes. As estruturas dos agregados da glicina são estabilizadas principalmente pela formação de uma rede de ligação de hidrogênio entre os grupos carboxílicos (COOH) dos monômeros da glicina. As formações das ligações de hidrogênios influenciam significativamente na estrutura molecular dos agregados, que, por sua vez, se refletem nas variações das propriedades de RMN. Entre os átomos do grupo – COOH, os deslocamentos químicos do carbono (C), do oxigênio (O) da ligação C = O (receptor de prótons) e o hidrogênio (H) do grupo O-H (doador de prótons), sofrem diminuições devido à formação da ligação de hidrogênio. O comprimento da ligação de hidrogênio formada entre os monômeros da glicina e a complexidade da estrutura variam com o número de monômeros presentes no agregado. Uma correlação direta entre o comprimento da ligação de hidrogênio e o deslocamento químico isotrópico das ligações de hidrogênios se observa em todos os casos.

Novas abordagens terapêuticas vêm sendo introduzidas para doenças musculares genéticas como distrofias musculares e miopatias congênitas, distúrbios que permanecem sem cura até o momento. Estes recentes avanços motivaram um interesse renovado e crescente por métodos não invasivos para a caracterização e monitoramento do músculo afetado, particularmente durante e após intervenções terapêuticas. Neste contexto, modelos animais são essenciais para uma melhor compreensão dos mecanismos das doenças e para testar novas terapias. Recentemente, avanços significativos na avaliação não invasiva de modelos murinos para doenças musculares genéticas foram alcançados. Entretanto, diversas linhagens de camundongos ainda não foram caracterizadas de maneira não invasiva, e ainda é necessário o desenvolvimento de métodos sensíveis para a identificação precoce de alterações sutis no músculo de camundongos afetados. A proposta desta tese é aplicar técnicas não invasivas inovadoras no estudo do músculo de modelos murinos para doenças musculares genéticas com fenótipos variados. Três modelos murinos para distrofias musculares (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) e um modelo murino para miopatia congênita (KI-Dnm2R465W) foram estudados com métodos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Duas linhagens distróficas (Largemyd, mdx/ Largemyd) e camundongos normais após injúria foram estudados através de micro-Tomografia Computadorizada (micro-CT). Em RMN, todas as linhagens de camundongos afetados apresentaram aumento de T2 muscular, o que foi relacionado a diversas anomalias na análise histológica, como necrose e inflamação, mas também a conjuntos de fibras em regeneração ou a fibras com citoarquitetura alterada. A combinação de RMN com análise de textura permitiu a identificação não ambígua de todas as linhagens distróficas, sendo que apenas a comparação dos valores de T2 muscular não permitiu esta diferenciação. Camundongos mdx mostraram alterações funcionais e morfológicas na rede vascular do músculo. Estudo piloto em camundongos KI-Dnm2R465W revelou tendências de comprometimento da função muscular. Por fim, imagens de micro-CT não permitiram a detecção de diferenças na composição muscular em camundongos distróficos. Este conjunto de resultados não apenas enriquece o painel de modelos murinos para doenças musculares genéticas caracterizados de maneira não invasiva, mas também demonstra um certo grau de especificidade nas anomalias observadas nas imagens, como revelado pela análise de textura. Estes resultados também mostraram que métodos não invasivos de RMN podem ser suficientemente sensíveis para identificar alterações sutis no fenótipo muscular murino, mesmo em estágios precoces. Esta tese foi desenvolvida sob acordo de co-tutela internacional entre a França e o Brasil, e compreendeu uma importante transferência de conhecimento, com os primeiros estudos não invasivos de músculo murino realizados no Brasil. / Novel therapeutic approaches are being introduced for genetic muscle diseases such as muscle dystrophies and congenital myopathies, all of them having remained without cure so far. These recent developments have motivated a renewed and augmented interest in non-invasive methods for muscle characterization and monitoring, particularly during and after therapeutic intervention. In this context, animal models are essential to better understand the disease mechanisms and to test new therapies. Recently, significant advances in the non-invasive evaluation of mouse models for genetic muscle diseases have been achieved. Nevertheless, there were still several mouse strains not characterized non-invasively, and it was necessary to develop sensitive methods to identify subtle alterations in the murine affected muscle. The purpose of this thesis was to apply non-invasive techniques in the study of murine models for genetic muscle diseases with variable phenotypes. Three mouse models for muscle dystrophy (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) and one mouse model for congenital myopathy (KI-Dnm2R465W) were studied with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) methods. Two dystrophic strains (Largemyd, mdx/ Largemyd) and normal mice after injury were studied through micro-Computed Tomography (micro-CT). On NMR, all affected mouse strains presented increased muscle T2, which could be related to variable features in the histological evaluation, including necrosis and inflammation, but also to clusters of fibers under regeneration or with altered cytoarchitecture. The combination of NMR and texture analyses allowed the unambiguous differential identification of all the dystrophic strains, although it was not feasible when comparing the muscle T2 measurements only. Mdx mice showed functional and morphological alterations of vascular network. In the KI-Dnm2R465W mice, a pilot study revealed tendencies of functional impairment. Finally, micro-CT images were unable to detect differences in muscle´s content in dystrophic mice. Altogether, these results not only increased the number of murine models for genetic muscle diseases non-invasively characterized, it also demonstrated some degree of specificity of the imaging anomalies, as revealed by texture analysis. It also showed that non-invasive NMR methods can be sensitive enough to identify subtle alterations in murine muscle phenotype, even in early stages. This thesis was developed under an international joint supervision between France and Brazil, and comprised an important transfer of technology, with the first non-invasive studies of murine muscles performed in Brazil.