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RNA-based engineering of inducible CRISPR-Cas9 transcription factors for de novo assembly of eukaryotic gene circuitsFerry, Quentin R. V. January 2017 (has links)
Synthetic biology in mammalian cells holds great promise for reverse engineering biological processes and rewiring cellular behaviors for therapeutic purpose. An essential aspect in our ability to reprogram the cellular code is the availability of highly orthogonal, inducible transcriptional regulators. CRISPR-based strategies employing effector-domain tethering to the single guide RNA (sgRNA)-dCas9 complex have greatly advanced this field by allowing for precise activation or repression of any gene via simple sgRNA reprograming. However, the implementation of inducible CRISPR-based transcriptional regulators (CRISPR-TRs) has so far been restricted to dCas9 protein engineering and conditional effector tethering. Although elegant, these approaches are limited by dCas9 promiscuous loading of sgRNAs, which hinders their use for the creation of independent multi-gene transcriptional programs. To address this limitation, I have developed a modular framework for the rational design of inducible CRISPR-TR, based on simple and reversible modifications of the sgRNA sequence. At the core of this conceptual framework lies the ability to inactivate native sgRNAs by appending on their 5'-end a short RNA segment, which folds to form a spacer-blocking hairpin (SBH). Base-pairing between the extension and the sgRNA spacer prevents docking of the CRISPR-TR on-target, fully abrogating its activity. Subsequently, I have created inducible SBH variants (iSBH) by replacing the hairpin loop with conditional RNA cleaving units. Using a variety of sensing-loops, I was able to engineer a panel of switchable iSBH-sgRNAs, designed to activate specifically in the presence of protein, oligonucleotide, and small molecule inducers. Leveraging the versatility of this method, I demonstrate that iSBH-sgRNAs expression can be multiplexed to assemble synthetic gene circuits implementing parallel and orthogonal regulation of multiple endogenous gene targets. Finally, I have distilled the design principles derived throughout this project to develop a web tool that automates the creation of iSBH- sgRNAs. Already a valuable addition to the synthetic biology toolkit, iSBH-based inducibility should in theory also be applicate to all CRISPR-Cas9 derivatives (genome editing, epigenetic alteration, DNA labelling, etc.) as well as other newly characterized RNA-guide nucleases from the CRISPR family.
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Études structurales et ingénierie du ribozyme VS de NeurosporaDagenais, Pierre 08 1900 (has links)
Les ARN non-codants exercent des rôles essentiels au sein de nombreux processus biologiques, allant de la régulation de l’expression génique à l’activité enzymatique. Afin de remplir leurs fonctions cellulaires, ces ARN doivent adopter des structures tridimensionnelles spécifiques, et mieux comprendre ces structures et leur dynamique est crucial pour élucider leur mécanisme d’action et créer des ARN possédant de nouvelles fonctions. Afin de mieux comprendre la structure, la dynamique et l’ingénierie des ARN, notre laboratoire étudie le ribozyme VS de Neurospora, un petit ARN (~160 nucléotides) possédant une activité catalytique.
Le ribozyme VS a été découvert il y a une trentaine d’années chez certains isolats naturels du champignon microscopique Neurospora. Ce ribozyme a fait l’objet d’études approfondies et est considéré comme étant un système modèle idéal pour étudier la structure et la fonction de l’ARN in vitro, en raison de sa taille relativement petite, de sa structure tridimensionnelle complexe et de son activité enzymatique facilement détectable. Comme plusieurs autres ribozymes de sa famille, le ribozyme VS catalyse des réactions de clivage et de ligation d’une liaison phosphodiester spécifique. Toutefois, il a la capacité unique de reconnaître et de cliver un substrat isolé, replié sous forme de tige-boucle, par l’entremise d’une interaction boucle-boucle extrêmement stable, une caractéristique intéressante d’un point de vue de l’ingénierie de l’ARN. Des structures cristallines récentes ont fourni de l’information importante à propos de l’état fermé du ribozyme, qui comprend un site actif pré-catalytique. Toutefois, des études récentes ont plutôt démontré que le ribozyme VS adopte un état ouvert en solution et il n’existe que très peu d’information structurale sur cet état et sur les mécanismes de transition menant à la forme fermée. Afin de caractériser la structure du ribozyme en solution, une stratégie modulaire de divide-and-conquer a été entreprise et des structures RMN à haute résolution de chacun des sous-domaines structuraux clés ont été déterminées.
Cette thèse vise à caractériser la structure du ribozyme VS complet en solution et à explorer sa capacité à cliver une molécule d’intérêt différente de son substrat naturel. Dans un premier temps, une étude d’ingénierie a été entreprise afin de créer des variants du ribozyme VS capables de reconnaître une tige-boucle d’ARN dérivée de l’Élément de Réponse de Transactivation du virus d’immunodéficience humaine (VIH). Ainsi, des variants hautement actifs du ribozyme ont été identifiés par sélection in vitro et une étude complémentaire de dynamique moléculaire a démontré que l’interaction boucle-boucle agit à titre de charnière dynamique et facilite la formation de l’état fermé du ribozyme. L’approche structurale de divide-and-conquer a ensuite été complétée en combinant des études de RMN et de diffusion des rayons-X aux petits angles (SAXS). Ainsi, des structures à haute résolution du domaine catalytique minimal et d’un complexe formé entre un ribozyme VS plus étendu et un substrat non-clivable ont alors été obtenus. En comparant ces structures aux structures cristallines, nous avons découvert un réarrangement structural important associé à la formation du site actif. Dans l’ensemble, ces travaux offrent une meilleure compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS et de son mécanisme d’action qui comprend un échange dynamique de multiples états conformationnels. Plus généralement, les leçons apprises ici permettront de mieux guider les expériences d’ingénierie du ribozyme VS et d’autres ARN fonctionnels. / Non-coding RNAs play essential roles in many biological processes, ranging from the regulation of gene expression to enzymatic activity. To perform their cellular functions, RNAs must adopt specific three-dimensional structures, and understanding how these structures fold is crucial to elucidate their mechanism of action. However, our fundamental understanding of the structure and dynamics of RNA at atomic resolution remains rather limited. To better understand the structure, dynamics and engineering of RNA, our laboratory is investigating the Neurospora VS ribozyme, a small RNA (~160 nucleotides) with catalytic activity.
The VS ribozyme was originally found 30 years ago in natural isolates of Neurospora fungi. It has been thoroughly investigated as an ideal model system to study the structure and function of RNA in vitro, due to its small size, its complex three-dimensional structure and easily detectable activity. Like other small nucleolytic ribozymes, the VS ribozyme catalyzes the cleavage and ligation reactions of a specific phosphodiester bond. However, it has the unique ability to recognize and cleave an isolated hairpin substrate through the formation of a highly stable kissing-loop interaction, which is of great interest for RNA engineering purposes. Recent crystal structures have provided useful information on the closed state of the ribozyme, in which the active site is formed. However, the VS ribozyme is also known to adopt an open state in solution and there is still very little structural information regarding this state and how it is converted into the active closed state. In order to characterize the solution structure of the ribozyme and its dynamics, an NMR-based divide-and-conquer approach was previously undertaken in which high-resolution structures of each of the key structural subdomains were determined.
The work presented in this thesis aims to characterize the structure of the complete VS ribozyme in solution and to explore its ability to cleave an RNA hairpin of interest, different from its natural substrate. First, an engineering study was undertaken to create VS ribozyme variants capable of recognizing an RNA stem-loop derived from the HIV-1 Trans-Activation Response Element RNA. Using in vitro selection, highly active ribozyme variants were identified, and their sequence analysis suggests that the improved activity observed in some variants depends on increased conformational sampling of the kissing-loop interaction. Complementary molecular dynamics studies indicate that the kissing-loop interaction acts as a dynamic hinge to facilitate the formation of the closed state
of the ribozyme. Next, the divide-and-conquer approach for structural investigation of the VS ribozyme was completed by combining NMR and small-angle X-ray scattering (SAXS) data. High-resolution structures were determined for both a minimal catalytic domain and a complex between a more extended trans ribozyme and a non-cleavable substrate. By comparing these solution structures to the previously reported crystal structures, we uncovered an important structural rearrangement associated with the formation of the active site. Overall, this work provides a better understanding of the global architecture of the VS ribozyme and how it fulfills its function by dynamic exchange of many conformational states. More generally, the structural and dynamic knowledge generated from this work will help to guide future engineering studies of the VS ribozyme and other functional RNAs.
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Études d'ingénierie du ribozyme VS de NeurosporaLacroix-Labonté, Julie 31 December 2015 (has links)
Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le
développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement
intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou
d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le
développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui
permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures
secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et
tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait
intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la
tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour
accomplir des fonctions biologiques.
Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle
de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité
pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des
travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité
nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat
naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents
substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces
modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été
modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs
de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de
tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans
modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a
été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut
reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel.
L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR*
de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de
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clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours
observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de
ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec
une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec
une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de
clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être
modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en
conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel
d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du
ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents
du substrat naturel du ribozyme VS. / Ribozymes are catalytic RNAs frequently exploited for the development of
biochemistry tools and therapeutic agents. They are particularly interesting in gene
inactivation strategies for the degradation of mRNA and viral RNA genome. Currently, the
most common ribozymes used in the development of therapeutic agents are the hammerhead
and hairpin ribozymes, which can specifically recognize and cleave target single-stranded
RNAs through the formation of stable secondary structures. In vivo, single-stranded RNAs
can be difficult to target because most RNA adopt complex secondary and tertiary structures.
It could be worthwhile to target folded RNA motifs, and an interesting target is the stem-loop
structure because stem-loops are important for the overall folding of RNA molecules and they
can perform important biological functions.
The Neurospora VS ribozyme recognizes its stem-loop folded substrate via a specific
kissing-loop interaction, but it has never been exploited for the recognition of target RNA very
different from its natural substrate. The goal of the work presented in this thesis is to
determine whether the VS ribozyme possesses the necessary adaptability for engineering
ribozymes that target RNAs different from its natural substrate. For this thesis, the VS
ribozyme was adapted for the recognition of different substrates and kinetic studies were
performed to evaluate the effect of these modifications on the cleavage activity. In a first
study, the VS ribozyme was modified to recognize and cleave substrates with different stem Ib
lengths. The VS ribozyme was successfully adapted to theses substrates of different lengths
with a cleavage activity similar to the unmodified ribozyme and substrate. In a second study,
the I/V kissing-loop interaction was substituted by rational design, in order to establish if the
VS ribozyme variants could recognize and cleave a substrate with a different loop than its
natural substrate. The I/V kissing-loop interaction was substituted for the HIV-1 TAR/TAR*
and the Deinococcus radiodurans RNA large rRNA subunit L22/L88 kissing-loop
interactions. The cleavage reaction was observed for the ribozymes with these new
interactions, but with reduced activity. Finally, in vitro selection (SELEX) was used to enable
more efficient cleavage of a mutant substrate with a new loop. SELEX experiments enabled
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the selection of ribozyme variants that cleave a substrate with a terminal loop mutated to that
of the HIV-1 TAR RNA with a very efficient cleavage activity. All of the studies presented in
this thesis show that the VS ribozyme can be modified in various ways for the specific
recognition of different substrates, while maintaining efficient cleavage activity. These results
demonstrate the great potential of VS ribozyme engineering and are very promising for further
engineering studies of VS-derived ribozymes for the cleavage of stem-loop folded target RNA
completely different from its natural VS ribozyme substrate.
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