Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:37:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morello_LuisGustavo_D.pdf: 80024877 bytes, checksum: 1848ac9901b4322b786b1dcd7a521a69 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram a interação entre as proteínas humanas SBDS e NIP7. SBDS participa da biogênese de ribossomos e sua deficiência está associada à síndrome de Shwachman- Bodian-Diamond. NIP7 é uma proteína conservada e já foi caracterizada em levedura, onde participa da formação da subunidade ribossomal 60S. Neste trabalho, nós investigamos o papel de NIP7 na síntese de ribossomos em células humanas. A depleção de NIP7 revelou defeitos no processamento do pré-rRNA associado à produção do rRNA 18S, causando déficit na formação da subunidade ribossomal 40S. Essa divergência de resultados entre a função de NIP7 em levedura e células humanas é consistente com o fato de que NIP7 humana não complementa levedura deficiente em Nip7p. Ainda, um rastreamento em sistema de duplo-híbrido tendo NIP7 humana como isca revelou parceiros de interação diferentes daqueles reportados para Nip7p em levedura. FTSJ3 foi a parceira isolada com maior frequência. FTSJ3 é a provável ortóloga de Spb1p em levedura, a qual está envolvida na formação da subunidade ribossomal 60S. A associação entre FTSJ3 e NIP7 foi demonstrada por ensaios de pull-down e imunoprecipitação, como sendo dependente de RNA. A co-localização nucleolar e co-sedimentação dessas proteínas em fracionamento em gradiente de sacarose corroboram a associação. Além disso, células humanas deficientes em FTSJ3 revelaram defeitos na via de maturação do rRNA 18S, mesma via afetada pela depleção de NIP7. Em adição, a caracterização proteômica de complexos contendo FTSJ3 e NIP7 revelaram que essas proteínas co-purificam complexos pré-ribossomais. Uma comparação entre o conjunto de proteínas que interagem com Spb1p e as proteínas identificadas nos ensaios de pull-down com FLAG-FTSJ3 revelou que elas apresentam apenas um ortólogo em comum, o qual, incrivelmente, é Nip7/NIP7. Essas observações revelaram diferenças significativas na função desses fatores durante a síntese de ribossomos em levedura e células humanas, adicionando NIP7 e FTSJ3 na lista crescente de fatores com funções divergentes nas vias de processamento do rRNA em levedura e humanos / Abstract: Previous studies from our laboratory have demonstrated the interaction between the SBDS and NIP7 human proteins. SBDS play a role in ribosome biogenesis and its deficiency is associated to the Shwachman-Bodian-Diamond syndrome. NIP7 is a conserved protein and has already been characterized in yeast, where it participates in the 60S ribosomal subunit formation. In this work, we investigated the role of NIP7 in ribosome biogenesis in human cells. NIP7 knockdown caused pre-rRNA processing defects associated to the 18S rRNA maturation, leading to deficiency in 40S ribosomal subunit synthesis. The divergence between NIP7 function in yeast and human cells is further supported by the fact that human NIP7 does not complement yeast deficient in Nip7p. In addition, a two-hybrid screen using human NIP7 as bait revealed interaction partners different from those reported for yeast Nip7p. FTSJ3 was isolated as one of the most frequent human NIP7-interacting candidates. FTSJ3 is a putative ortholog of yeast Spb1p, which has been implicated in 60S ribosomal subunit synthesis. The association between FTSJ3 and NIP7 was showed by pull-down and immunoprecipitation assays as an RNA-dependent interaction. Nucleolar colocalization and co-sedimentation on a sucrose gradiente fractionation corroborate this association. Furthermore, RNAi-mediated knockdown revealed that depletion of FTSJ3 causes pre-rRNA processing defects in the pathway leading to 18S rRNA maturation, the same pathway affected by NIP7 downregulation. In additon, proteomic characterization of FTSJ3- and NIP7- containing complexes showed that these proteins copurify pre-ribosomal complexes. A comparison of the set of Spb1p-interacting proteins with the proteins identified in the pulldown with FLAG-FTSJ3 showed that they share only one ortholog which, incredibly, is Nip7/NIP7. These observations revealed significant differences in the function of these factors during the synthesis of ribosomes in yeast and human cells, adding NIP7 and FTSJ3 to the growing list of factors with different functions in yeast and human rRNA processing pathways / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T14:04:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_CynthiaCanedoda_D.pdf: 9736339 bytes, checksum: 506af9b64177978ae4c3c5c0588e1b28 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os efluentes de refinarias contêm vários compostos tóxicos, que podem provocar sérios danos aos seres vivos se não tratados previamente. Os fenóis são poluentes encontrados em efluentes de diversas indústrias, incluindo as refinarias de petróleo, e são conhecidos como um dos compostos mais tóxicos encontrados no meio ambiente. Portanto, há necessidade constante de buscar formas de remover ou reduzir a presença destas substâncias nos efluentes. Este trabalho teve como objetivos analisar e explorar a diversidade microbiana presente em lodo de sistemas de tratamento de efluentes de refinarias petróleo, através da construção de bibliotecas de genes RNAr 16S e bibliotecas metagenômicas em vetores do tipo fosmídeo. Análises filogenéticas das bibliotecas de genes RNAr 16S e metagenômicas mostraram uma comunidade bacteriana bastante diversa, com predominância do Filo Proteobacteria, seguido de Actinobacteria, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Cloroflexi e Bacteroidetes. Dentre os gêneros mais abundantes, se destacaram Thauera, Comamonas, Diaphorobacter e Thiobacillus. Espécies pertencentes a estes gêneros realizam o processo de desnitrificação e espécies de Thauera e Comamonas estão relacionadas com a degradação de compostos aromáticos. A grande diversidade bacteriana refletiu em uma ampla diversidade metabólica, sendo obtido um grande número de resultados para genes relacionados com processos biológicos importantes para o tratamento de efluentes, como o metabolismo de nitrogênio, enxofre, fósforo, além de genes relacionados com o catabolismo de compostos aromáticos, tais como benzoato, bifenil e fenol. Adicionalmente, foram observadas possíveis novas sequências para os genes que codificam enzimas-chaves responsáveis pela meta-clivagem de fenol e outros aromáticos, como fenol hidroxilase e catecol 2,3-dioxigenase. No presente estudo foram também realizadas triagens funcionais dos 13.200 clones para enzimas hidrolíticas, com detecção de dois hits para esterase e um para lipase. Este trabalho mostrou que a bioprospecção genômica microbiana é uma estratégia inovadora na área de tratamento de efluentes, que pode contribuir para o conhecimento da microbiota responsável pela degradação dos poluentes. / Abstract: Refinery wastewater has several toxic compounds that may cause serious damage to life. Phenolic compounds are found in several industrial effluents, including petroleum refinery, and represent a significant environmental toxicity hazard. Therefore, there is a constant need to search for new technologies able to remove and reduce the presence of these substances in wastewater. This study aimed to analyze and explore the microbial diversity present in sludge from refinery wastewater treatment systems through the construction of 16S rRNA genes libraries and metagenomic libraries in fosmid vectors. Sequencing and phylogenetic analyses of libraries showed a highly diverse bacterial community, with predominance of the Proteobacteria phylum, followed by Actinobacteria, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Cloroflexi and Bacteroidetes. The most abundant genera were Thauera, Comamonas, Diaphorobacter and Thiobacillus. Species belonging to these genera are facultative anaerobic and may be involved with the denitrification process, and Thauera and Comamonas species are related with degradation of aromatic compounds. This bacterial diversity reflected in a broad metabolic diversity. Analysis of the metagenomic data derived from pyrosequencing revealed a lot of hits related with biological processes of great relevance for wastewater treatment, such as genes for nitrogen, sulfur and phosphorus metabolism, in addition to genes related to the catabolism of aromatic compounds, such as benzoate, biphenyl and phenol. Additionally, sequences representing possible new genes encoding for key-enzymes responsible for the meta-cleavage of phenol and other aromatic compounds, such as phenol hydroxylase and cathecol 2,3-dioxygenase, were found in the fosmid libraries. Finally, high-throughput functional screening of 13,200 clones for hydrolytic enzymes yielded two positive hits for lipase and one for esterase. The data gathered together in this work showed that microbial genomic prospection is an innovative strategy for the wastewater treatment system that may undoubtedly contribute to the knowledge of microorganisms responsible by pollutant degradation. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T15:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coltri_PatriciaPereira_D.pdf: 4564852 bytes, checksum: f11b831da981a8969c20f8f03ae8c617 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A síntese de ribossomos é um processo conservado em eucariotos e se inicia com a transcrição dos rRNAs no nucléolo. Mais de 170 fatores atuam de forma transitória no processamento dos precursores para gerar os rRNAs maduros que formarão as subunidades ribossomais no citoplasma. Entre as proteínas envolvidas na síntese de ribossomos está a Nip7p, uma proteína nucleolar de 21 kDa associada ao complexo pré-60S em Saccharomyces cerevisiae. Nip7p é conservada e possui ortólogas em eucariotos e em Archaea. A análise da seqüência primária revela a presença de um domínio conservado na região C-terminal, denominado PUA, encontrado em diversas proteínas associadas a modificações no RNA. Neste trabalho, foram realizadas análises estruturais e funcionais com o objetivo de investigar a função molecular da proteína Nip7 no processamento e modificação do rRNA. A estrutura tri-dimensional de PaNip7, ortóloga de Nip7p em Pyrococcus abyssi foi resolvida por difração de raios-X até 1,8Å de resolução, utilizando o método SIRAS. Comparação estrutural seguida por ensaios in vitro confirmaram o envolvimento do domínio PUA na interação com RNA. Além disso, tanto Nip7p como suas ortólogas PaNip7 e HsNip7 interagem com seqüências ricas em uridina, indicando que atuam de forma semelhante no processamento do rRNA. Essa preferência por uridina pode ainda explicar a afinidade da proteína Nip7p de S. cerevisiae pelo RNA da região ITS2, conforme observado em ensaios de interação utilizando UV-crosslinking. De fato, uma análise funcional realizada por primer extension comprovou que ocorre um bloqueio no processamento da região espaçadora ITS2 na ausência de Nip7p. Nip7p interage com várias proteínas do complexo pré-60S, entre as quais Nop8p e Nop53p, ambas associadas ao processamento do pré-27S. Embora os ensaios de co-purificação tenham confirmado a interação com as proteínas do complexo H/ACA box, deficiência em Nip7p não afeta a pseudo-uridinilação do rRNA. O duplo-híbrido realizado com a ortóloga humana de Nip7p, HsNip7, revelou interações com FTSJ3 e com a proteína SUMO-2. A interação direta de HsNip7 com estas proteínas foi confirmada por ensaios in vitro. HsNip7 e FTSJ3 colocalizaram na região nucleolar de células HEK293. FTSJ3 é uma proteína não caracterizada que possui o domínio FtsJ, descrito inicialmente para rRNA metiltransferases de procariotos. Além disso, FTSJ3 apresenta similaridade de sequência à proteína Spb1p de levedura, cuja função na metilação do rRNA 25S na posição Gm2922 já foi estabelecida. Embora a Nip7p não interaja com a Spb1p, estes dados indicam que FTSJ3 deve ser a ortóloga humana da Spb1p. As proteínas SUMO estão envolvidas na modificação pós-traducional (sumoylation) que regula a localização subcelular de proteínas. Em levedura, a provável ortóloga de SUMO, Smt3p, foi descrita na partícula pré-60S, portanto a interação HsNip7-SUMO-2 pode ser específica. Estes dados sugerem que as proteínas atuem no mesmo complexo da formação da subunidade 60S também em células humanas / Abstract: Ribosome biogenesis is conserved throughout eukaryotes and takes place in the nucleolus, a specialized nuclear compartment where the rRNA precursors are transcribed. More than 170 trans-acting factors coordinately interact to generate the mature rRNAs. Among the proteins identified in the pre-60S particle in Saccharomyces cerevisiae is Nip7p. Highly conserved Nip7p orthologues are found in all eukaryotes and Archaea. The analysis of Nip7p sequence reveals a conserved C-terminal domain named PUA, also found in a number of RNA-interacting proteins. In this work, we performed structural and functional analysis to investigate Nip7p molecular role on rRNA processing and modification. The structure of Pyrococcus abyssi Nip7p ortholog, PaNip7, was solved using X-ray diffraction data to 1,8Å resolution. Structural analysis followed by in vitro assays confirmed the involvement of PUA domain in RNA interaction. S. cerevisiae Nip7p and its archaeal and human counterparts show preference for binding uridine-rich sequences, indicating conserved functional features among the orthologues. The preference for uridine can explain the higher affinity of S. cerevisiae Nip7p for ITS2 sequence, as observed by UV-crosslinking assays. Consistently, functional analysis revealed pre-rRNA processing in the ITS2 region is seriously impaired. Yeast two-hybrid analysis confirmed by pull down assays revealed Nip7p interacts with Nop8p and Nop53p, two nucleolar proteins involved in pre-27S processing and components of pre-60S particle. Although yeast two-hybrid and pull down assays indicated that Nip7p interacts with H/ACA box core proteins, pseudouridylation is not affected under conditions of Nip7p depletion. In addition, yeast two-hybrid analysis confirmed by GST-pull down revealed HsNip7 interaction with FTSJ3 and SUMO-2. Both HsNip7 and FTSJ3 showed nucleolar subcellular localization in HEK293 cells. FTSJ3 is an uncharacterized protein containing the FtsJ domain, initially described in prokaryotic rRNA methyl-transferases. FTSJ3 shows sequence similarity to yeast Spb1p, an rRNA methyl-transferase involved in methylation of Gm2922, indicating that FTSJ3 may be the human orthologue of Spb1p. Sumoylation is a post-transcriptional covalent modification involved in regulation of protein subcellular localization. Putative yeast orthologues of SUMO, such as Smt3p, have been described in the pre-60S ribosomal particle, suggesting that SUMO-2 might play a specific role in 60S subunit biogenesis / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular