Mitochondria are key generators of cellular ATP, vital to complex life. Historically, mitochondrial generation of reactive oxygen species (ROS) was considered to be an unregulated process, produced by dysfunctional mitochondria. More recently, mitochondrial ROS generated by complex I, particularly by the process of reverse electron transfer (RET), has emerged as a potentially biologically relevant signal that is tightly-regulated and dependent on mitochondrial status. ROS production by RET is reported to play a role in the innate immune response and lifespan extension in fruit flies. One way in which mitochondrial ROS may behave as a signal is by altering the activity of AMP-activated protein kinase (AMPK), a key metabolic sensor and regulator of cell metabolism, which is activated when cellular ATP levels decrease during energy demand. Mitochondria can signal to AMPK via the magnitude of the cellular ATP/AMP and ATP/ADP ratios, which alter in response to mitochondrial function. Our view is mitochondria may also signal to AMPK via ROS. Important studies have helped to clarify the role of exogenous or cytosolic ROS in AMPK regulation. However, the effects of mitochondrial ROS on AMPK activity, specifically that generated by complex I, remain unclear and is the main focus of this thesis. I characterized the effects of exogenous H2O2 on cellular AMPK activity, ATP/ADP ratios and cellular redox state in a cell model. I then compounded this with selective mitochondria generated ROS by the mitochondria-targeted redox-cycler, MitoParaquat (MPQ). AMPK activity appeared to correlate with decreasing cell ATP/ADP ratios, indicating that both sources of ROS primarily activate AMPK in an AMP/ADP-dependent mechanism. In parallel, I developed an approach for analyzing the redox state of candidate proteins, an important step in determining if a protein is directly regulated by ROS. I also initiated development of a cell model for studying the downstream effects of mitochondrial ROS production by RET, by expressing alternative respiratory enzymes in a mammalian cell line.

Les radiations ionisantes sont une cause établie de cancers de la thyroïde mais un nombre croissant de travaux évoque aussi le rôle potentiel du peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans la pathogenèse des cancers thyroïdiens spontanés. Si les cassures double-brin de l’ADN (DSBs) sont considérées comme l’une des causes primaires de cancer, leur induction par l’H2O2 était plus controversée.<p><p>Lors de ce travail, nous avons voulu tester in vitro, dans différents modèles thyroïdiens, l’hypothèse selon laquelle l’H2O2 produit en grandes quantités in vivo pour oxyder l’iodure et synthétiser les hormones thyroïdiennes pouvait endommager l’ADN. <p>Les dégâts provoqués à l’ADN ont été évalués par le test des comètes (en milieu alcalin pour les cassures simple-brin (SSBs) et en milieu neutre pour les cassures double-brin de l’ADN) et quantitativement comparés à ceux produits par l’irradiation.<p>Nous avons montré dans une lignée cellulaire thyroïdienne de rat (PCCl3) que des concentrations non létales d’H2O2 (0.1 – 0.5 mM) tout comme l’irradiation (1 - 10 Gy) provoquaient une augmentation dépendante de la dose du nombre de SSBs et de DSBs. <p>L'induction de DSBs a été confirmée par la mesure du taux de phosphorylation de l’histone H2AX sur Sérine 139. L’induction de DSBs par l’H2O2 a également été observée dans des cultures primaires de thyroïdes humaines et dans des tranches de thyroïde de porcs.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui empêche le renouvellement du glutathion cellulaire, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN induites par l’H2O2. <p>Nous avons également observé que les dommages de l’ADN étaient réparés plus lentement lorsqu’ils étaient provoqués par l’H2O2 plutôt que par l’irradiation. <p><p>Dans un second temps, nous avons exploré au niveau moléculaire les conséquences d’une exposition à 1 Gy d’irradiation γ ou à une concentration non létale d’H2O2 (0.05 – 0.2 mM) dans des cultures primaires de thyroïdes humaines et dans des lymphocytes T issus d’un même donneur. Nous avons étudié par micro-arrays les modifications du profil d’expression génétique de ces 2 types cellulaires afin de caractériser la spécificité de la réponse transcriptionnelle en fonction de la nature de l’agression, du type et de l’importance du dommage engendré ainsi que du type cellulaire.<p>Les 2 types cellulaires répondent de manière similaire à l’irradiation en termes de nombre de gènes régulés, avec un large recouvrement de réponses transcriptionnelles caractérisées par une forte sur-représentation de gènes impliqués dans l’apoptose et dans la réparation des dommages de l’ADN.<p>En revanche, la réponse transcriptionnelle à l’H2O2 est différente dans les 2 types cellulaires.<p>D’une part, les lymphocytes T qui montrent un dommage à l’ADN pour de plus faibles concentrations d’H2O2 que les thyrocytes présentent une réponse transcriptionnelle 1000 fois supérieure à celle observée dans les thyrocytes. D’autre part, les quelques gènes régulés dans les thyrocytes ne le sont pas dans les lymphocytes T. Il s’agit de gènes impliqués dans la défense contre les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces résultats suggèrent l’existence de mécanismes de protection anti-oxydante spécifiquement développés dans les cellules thyroïdiennes.<p><p>En conclusion, ce travail a montré que l’H2O2, à des concentrations non létales, provoque des SSBs mais également des DSBs dans différents modèles thyroïdiens in vitro. La quantité de DSBs produite par l’H2O2 est comparable à celle observée après irradiation mais la vitesse de leur réparation est plus lente. D’autre part, en comparaison avec les lymphocytes T, les thyrocytes semblent particulièrement résistants aux effets de l’H2O2 et dotés de mécanismes de protection particulièrement performants et probablement partiellement inductibles contre les ROS.<p>Ces données soutiennent notre hypothèse de départ selon laquelle la production d’H2O2 dans la thyroïde pourrait jouer un rôle dans l’étiopathogénie des tumeurs thyroïdiennes, en particulier en cas de défenses anti-oxydantes altérées.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished