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La propriété d’être réversiblement commutable de certaines protéines fluorescenteshomologues à la GFP ouvre un vaste champ d’applications possibles: notamment le biostockagede données à haute densité et la microscopie à super résolution. Parmi ces protéines,on trouve plusieurs variantes de la GFP, notamment la protéine jaune YFP, et des protéinesfluorescentes issues d'espèces marines Anthozoaires, comme Dronpa ou Padron. Plusieursétudes structurales indiquent que ces protéines fluorescentes photochromiques commutent parisomérisation et protonation couplées du chromophore. Cependant, la synchronisation entreces deux événements, le détail des mécanismes de photo-commutation, et le rôle de ladynamique conformationelle restent incomplètement compris. Par l'utilisation combinée de lacristallographie cinétique et de la spectroscopie optique in cristallo à basse température, nousavons comparé le comportement des protéines YFP, Dronpa et IrisFP, et nous avons étudié endétail le mécanisme photo-physique de commutation chez la protéine Padron. Contrairement àDronpa et IrisFP, la photo-commutation d’YFP est plus efficace à basse température qu’àtempérature ambiante. Nos résultats suggèrent que le mécanisme de commutation d’YFPn'implique pas de changement conformationel majeur, mais plutôt une protonation photoinduitedu chromophore ne nécessitant pas d'isomérisation. Au contraire, les études réaliséessur la protéine Padron nous ont permis de montrer que, dans ce cas, l’isomérisation duchromophore peut se produire indépendamment de sa protonation, et, étonnamment, àtempérature cryogénique. De plus, deux états intermédiaires ont pu être caractérisés au coursdu processus de photo-commutation. La protéine Padron a permis de mettre à jour le premiermarqueur codable génétiquement qui soit efficacement photo-commutable à températurecryogénique. / The property to be reversible switchable of some homologues fluorescents protein ofGFP open a large field for possible applications: such as, high-density data bio-storage andsuper-resolution microscopy. Between these proteins, we find several variants of GFP, such asyellow fluorescent protein, YFP, and fluorescents protein from marine Anthozoary species, asDronpa or Padron. Several structural studies suggest that these fluorescent proteins switch viaisomerization coupled with the protonation of the chromophore. However, thesynchronization between these processes, the detail about the photo-switching mechanism,and the role of conformational dynamics remains unclear. In combination of the kineticcrystallography and the optic spectroscopy in cristallo at low temperature, we have comparedthe YFP behavior, Dronpa and IrisFP, and we have studied in detail the photo-physicmechanism of Padron switching. In contrast to Dronpa and IrisFP, the YFP photoswitching ismore efficient at low temperature than at room temperature. Our results suggest that theYFPswitching is not associated to large structural rearrangements, but mostly a photo-inducedprotonation of the chromophore without isomerization. On the contrary, the studies done withPadron allowed us to show, in this case, the chromophore isomerization can be producedindependently of the protonation, at cryo-temperatures. Moreover, two intermediate stateswere revealed in the photo-pathway. Padron fluorescent protein allows to advance the firstgenetically inserted dye, being photo-switchable at cryogenic temperature

La découverte des Protéines Fluorescentes Phototransformables (PTFPs) issuesd’espèces anthozoaires a ouvert, grâce à leurs propriétés photophysiques particulières, unvaste champ d’investigation pour l'imagerie biologique de fluorescence. L'un des sousgroupesdes PTFPs est formé des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables(RSFPs), qui peuvent être commutées réversiblement entre des états non-fluorescent etfluorescent. Le photoblanchiment est la perte définitive d’émission de fluorescence sousexcitation et est un phénomène commun à toutes les molécules fluorescentes. Lephotoblanchiment a un impact important sur la qualité des images de microscopie, notammenten imagerie de super-résolution. Les RSFPs ont tendance à perdre de leur performance àchaque cycle de commutation, un processus dénommé “photofatigue”. Notre intérêt est centrésur l'étude des mécanismes de photofatigue des RSFPs.Nous avons rapporté les structures cristallographiques d’IrisFP photoblanchie par uneforte et une basse intensité d’illumination à température ambiante ainsi que les modificationsspectroscopiques associées. Nos résultats démontrent que différentes intensités d'excitationpeuvent donner lieu à différentes voies de photoblanchiment. Sous faible intensité d'excitation,une voie de photoblanchiment dépendante de l'oxygène a été mise en évidence. Lesmodifications structurales induites par la production d'oxygène singulet à l'intérieur de lapoche du chromophore ont révélé l'oxydation de deux résidus soufrés, Met159 et Cys171,piégeant le chromophore dans un état protoné non-fluorescent. Sous haute intensitéd'excitation, une voie de photoblanchiment oxygène-indépendante totalement différente a ététrouvée. Le Glu212, strictement conservé, subit une décarboxylation associée à un importantréarrangement du réseau de liaisons hydrogènes autour du chromophore, et un changementd’hybridation sp2 vers sp3 du carbone reliant les cycles du chromophore est observé. En tantque résidu clé impliqué dans le photoblanchiment induit par faible intensité d'excitation, nousavons muté Met159 en alanine afin d'éviter une sulfoxydation. Nous avons trouvé que lemutant IrisFP-M159A démontre une photostabilité améliorée en solution, en gel PVA et dansdes cellules E. coli. / The discovery of phototransformable FPs (PTFPs) from Anthozoa species, thanks totheir photophysical properties, has opened a large field in biological fluorescence imaging.One of the PTFPs’ sub-groups consists of Reversible Photoswitchable Fluorescent Proteins(RSFPs), which can be reversibly switched between nonfluorescent and fluorescent states.Photobleaching is the permanent loss of the fluorescence-emitting capacity under excitation,which is a common phenomenon among all the fluorescent molecules. Photobleaching has alarge impact on the microscopy image quality, notably on super-resolution imaging.Photoswitchable fluorescent proteins have a tendency to lose performance within everyswitching cycle, a process referred to as “photofatigue”. Our interest of study is focused onthe photobleaching mechanisms of RSFPs.We have reported the crystallographic structure of photobleached IrisFP under highand low illumination intensity at room temperature as well as its spectroscopic modifications.We found that different illumination intensities can result in different photobleachingpathways. Under low illumination intensity, an oxygen-dependent photobleaching pathwaywas evidenced. Structural modifications induced by singlet-oxygen production within thechromophore pocket revealed the oxidation of two sulfur-containing residues, Met159 andCys171, locking the chromophore in a nonfluorescent protonated state. Under highillumination intensity, a completely different, oxygen-independent photobleaching pathwaywas found. The conserved Glu212 underwent decarboxylation concomitantly with anextensive rearrangement of the H-bond network around the chromophore, and an sp2-to-sp3hybridization change of the carbon atom bridging the chromophore cyclic moieties wasobserved. As Met159 is the key residue involved in low-intensity illumination photobleaching,we have then mutated Met159 into Alanine in order to avoid sulfoxidation. We found that theIrisFP-M159A mutant display an enhanced photostability in solution, in PVA gel and inE.coli cells.

La propriété d'être réversiblement commutable de certaines protéines fluorescenteshomologues à la GFP ouvre un vaste champ d'applications possibles: notamment le biostockagede données à haute densité et la microscopie à super résolution. Parmi ces protéines,on trouve plusieurs variantes de la GFP, notamment la protéine jaune YFP, et des protéinesfluorescentes issues d'espèces marines Anthozoaires, comme Dronpa ou Padron. Plusieursétudes structurales indiquent que ces protéines fluorescentes photochromiques commutent parisomérisation et protonation couplées du chromophore. Cependant, la synchronisation entreces deux événements, le détail des mécanismes de photo-commutation, et le rôle de ladynamique conformationelle restent incomplètement compris. Par l'utilisation combinée de lacristallographie cinétique et de la spectroscopie optique in cristallo à basse température, nousavons comparé le comportement des protéines YFP, Dronpa et IrisFP, et nous avons étudié endétail le mécanisme photo-physique de commutation chez la protéine Padron. Contrairement àDronpa et IrisFP, la photo-commutation d'YFP est plus efficace à basse température qu'àtempérature ambiante. Nos résultats suggèrent que le mécanisme de commutation d'YFPn'implique pas de changement conformationel majeur, mais plutôt une protonation photoinduitedu chromophore ne nécessitant pas d'isomérisation. Au contraire, les études réaliséessur la protéine Padron nous ont permis de montrer que, dans ce cas, l'isomérisation duchromophore peut se produire indépendamment de sa protonation, et, étonnamment, àtempérature cryogénique. De plus, deux états intermédiaires ont pu être caractérisés au coursdu processus de photo-commutation. La protéine Padron a permis de mettre à jour le premiermarqueur codable génétiquement qui soit efficacement photo-commutable à températurecryogénique.

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