Orientador: Jane Megid / Banca: Hélio Langoni / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A utilização de métodos sensíveis e específicos para o diagnóstico da raiva constitui uma importante ferramenta para o controle e profilaxia dessa enfermidade. A Reação em Cadeia pela Polimerase através de Transcriptase-Reversa (RT-PCR) tem sido utilizada com bons resultados no diagnóstico do vírus rábico, mesmo quando as amostras estão em estágio de decomposição. Adicionalmente as técnicas moleculares têm sido utilizadas para estudos epidemiológicos possibilitando um melhor conhecimento da epidemiologia viral. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as técnicas de RT-PCR e hnRT-PCR para a detecção do vírus rábico em estudos retrospectivos, para isso foram avaliadas 101 amostras cerebrais de diferentes espécies animais armazenadas por diferentes períodos, recém-descongeladas e mantidas em temperatura ambiente por 72 horas para decomposição. Os resultados das técnicas de RT-PCR e hnRT-PCR foram comparados com resultados prévios da Imunofluorescência Direta (IFD) e Inoculação Intracerebral em Camundongos (IC). Das 50 amostras positivas testadas, 26 (52%) apresentaram resultados positivos para a RT-PCR e 45 (90%) com a associação da hnRT-PCR quando realizadas em amostras recentemente descongeladas. Das amostras em decomposição foram analisadas 48 previamente positivas; onde 17 (34,3%) apresentaram resultado positivo para a RT-PCR e 36 (75%) com a associação da hnRT-PCR. Não foram encontrados resultados falso-positivos nas amostras negativas submetidas às técnicas de biologia molecular. A hnRT-PCR apresentou maior sensibilidade em relação à RT-PCR nas amostras recém-descongeladas e em decomposição. Os resultados sugerem a viabilidade de sua aplicação em estudos retrospectivos em materiais descongelados e decompostos. / Abstract: The use of methods, both sensitive and specific, for rabies diagnosis are important tools for the control and prophylaxis of the disease. Reverse-Transcriptase Polymerse Chain Reaction (RT-PCR) has been used in rabies diagnosis with good results, even in decomposed materials. Additionally, molecular techniques have been used for epidemiological studies and better knowledge of viral epidemiology. The aim of this work was to evaluate the RT-PCR and hnRT-PCR in rabies virus detection in retrospectives studies. RT-PCR and hnRT-PCR were evaluated in 151 brain samples from different animal species, thawed and left at room temperature for 72 hours for decomposition. The RT-PCR and hnRT-PCR results were compared with preview results from Fluorescent Antibody Test and Mouse Inoculation Test. From the 50 positive fresh samples, 26 (52%) were positive for RT-PCR and 45 (90%) for hnRT-PCR. From the 48 positive decomposed samples, 17 (34, 3%) were positive for RT-PCR and 36 (75%) for hnRT-PCR. No false-positives results were found in the negatives samples submitted to the molecular techniques. These results show that the hnRT-PCR was more sensitive than RT-PCR, and both techniques presented lower sensibility in decomposed samples. The hnRT-PCR presented greater sensibility than the standards techniques (IFD e IC) in decomposed materials for rabies diagnosis. These results suggest the viability of the application of molecular techniques in thawed and decomposed materials for retrospective studies. / Mestre

Orientador: Luzia Helena Queiroz da Silva / Banca: Wagner André Pedro / Banca: Wilson Uieda / Resumo: A riqueza de espécies da fauna de morcegos e a ocorrência de vírus rábico foram avaliadas em área urbana (municípios da região de Araçatuba) e florestal (fragmento localizado no município de Valparaíso-SP), ambos localizados na região noroeste do Estado de São Paulo. Os morcegos da área urbana foram recebidos diretamente no laboratório de diagnóstico de raiva da UNESP - Campus de Araçatuba no período de 2006 a 2007. Morcegos da área florestal foram capturados mensalmente, no período de um ano de coletas em 2007, resultando em uma baixa diversidade de espécies. As amostras das duas áreas foram submetidas ao exame de diagnóstico de raiva, por meio das técnicas de imunofluorescência direta (IDF) e inoculação intracerebral em camundongos. Foram analisados 968 morcegos pertencentes a quatro famílias, Phyllostomidae, Noctilionidae, Molossidae e Vespertilionidae. Os morcegos observados em ambas as áreas no período de 2007 resultaram em uma similaridade na composição das espécies representada pela família Phyllostomidae. Morcegos da família Molossidae foram registrados na sua maioria em áreas urbanas, observando-se somente uma espécie no fragmento Florestal. A taxa de positividade na área urbana no período de 2006 a 2007 foi de 0,72%, inferior à média registrada em estudos anteriores, sendo os casos positivos em morcegos de hábito alimentar frugívoro e insetívoro. Todos os morcegos da área florestal foram negativos para o diagnóstico da raiva. O estudo pode contribuir para o conhecimento da diversidade de morcegos e a epidemiologia da raiva na região. / Abstract: The species richness of bat fauna and the ocurrence of rabies virus were studied in urban (municipal districts from Araçatuba region) and natural (forest fragment in Valparaiso town) environments, both located in the Northwestern Sao Paulo State. Bats from the natural forest were collected with mist nets in four different areas: forest, boarding areas, natural clearings in the woods and areas close to water and food sources. Urban samples were composed by bats, sent to UNESP Rabies Laboratory, for rabies virus research by fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT). A total of 968 bats belonging to four families, Phyllostomidae, Noctilionidae, Molossidae e Vespertilionidae, were analyzed. The results obtained from both areas showed a closed similarity in the composition of species and some particularities in the distribution of species according to trophic guilds in bats from Phyllostomidae family. Most of bats from the Molossidade family were recorded in urban areas, with only one species in the forest fragment. Considering all samples, 0,72% was rabies positive, a lower index compared to the mean index registered in the last years. All the positive cases occurred in frugivorous and insectivorous bats. This study was important to improve the knowlegment of bat diversity and rabies epidemiology in this specific region. / Mestre

Orientador: Jane Megid / Banca: Hélio Langoni / Banca: Avelino Albas / Resumo: Morcegos vêm recebendo crescente importância em Saúde Pública, pois são os principais reservatórios para a raiva em diversas partes do mundo. Pouco se conhece a respeito da distribuição do vírus rábico em tecidos e órgãos não nervosos. O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição do vírus rábico em órgãos e tecidos de quirópteros naturalmente infectados de diferentes hábitos alimentares, e avaliar a existência de alguma possível correlação com a filogenia das amostras. Foram utilizados 26 morcegos previamente diagnosticados positivos para raiva pelos métodos padrão, sendo coletado cérebro, glândulas salivares, pulmão, coração, fígado, baço, estômago, intestinos, rins, bexiga, gordura interescapular e fezes. As amostras foram submetidas à extração do material genético e submetidas à reação de RT-PCR com iniciadores específicos para o gene N. As amostras que resultaram negativas na primeira reação foram submetidas a uma segunda amplificação (hemi-nested PCR). Os produtos amplificados foram submetidos ao sequenciamento genético e as sequências alinhadas com sequências homólogas obtidas do GenBank para construção da árvore filogenética. Os resultados demonstraram uma ampla distribuição do vírus em órgãos e tecidos dos morcegos, não sendo possível correlacionar com a espécie e tão pouco com a linhagem viral encontrada. O maior percentual de positividade foi encontrado em cérebro e glândula salivar e a técnica de heminested PCR demonstrou ter maior sensibilidade na detecção do vírus rábico nas amostras estudadas. Na análise filogenética observou-se o agrupamento das amostras de acordo com as espécies, confirmando a existência de linhagens gênero específicas / Abstract: Bats have been assigned an increasing importance in Public Health as these are the main rabies reservoirs in many parts of the world. Little is known about the distribution of rabies virus in non-nervous tissues and organs. The aim of this study was to evaluate the distribution of rabies virus in organs and tissues of naturally infected bats with different feeding habits, and evaluate the existence of any possible correlation with the phylogeny of the samples. 26 bats previously diagnosed as positive for rabies by standard methods were used; the brain, salivary glands, lung, heart, liver, spleen, stomach, intestine, kidneys, urinary bladder, interscapular fat and feces were collected. The genetic material were extracted and submited to RT-PCR reaction with specific primers for the N gene. The samples that were negative in the first reaction underwent a second amplification (hemi-nested PCR). The amplified products were subjected to genetic sequencing and the sequences aligned with homologous sequences obtained from GenBank for phylogenetic tree construction. The results showed a wide distribution of virus in organs and tissues of bats, it was not possible to correlate the viral distribuition with the species nor with the viral strain found. The highest percentage of positivity was found in brain and salivary glands and the technique of heminested PCR demonstrated to have a greater sensitivity for detection of rabies virus in the studied samples. The phylogenetic analysis showed the clustering of samples according to the species, confirming the existence of genus specific lineages / Mestre