Abstract Epithelial cell-cell adhesions have a critical role in morphogenesis, establishment and maintenance of tissue architecture, cell-cell communication, normal cell growth and differentiation. These adhesions are disrupted during malignant transformation and tumour cell invasion. Several kinases, phosphatases and small GTPases regulate cell-cell contacts. In the present work we investigated the dynamics of cell-cell adhesion structures after microinjection of fluorophore tagged vinculin, during transformation caused by an active Src tyrosine kinase and during Helicobacter pylori infection. The regulatory role of Rac GTPase as well as the behaviour of actin and cadherin were analysed in all these conditions. Microinjection of vinculin into bovine kidney epithelial MDBK cells induced release of actin, cadherin and plakoglobin to cytoplasm of the cells, caused disruption of protein complexes at adherens and tight junctions that finally led to formation of polykaryons. Activated Rac GTPase, in turn, enhanced accumulation of cadherin to membranes and thereby diminished the formation of polykaryons, whereas inactive Rac removed cadherin from membranes. Incorporation of vinculin to lateral membranes took place also in acidifying and depolarising conditions where cell fusions were prevented. Thus, the membrane potential seemed to control fusion ability. In src-MDCK cells, activation of Src kinase led to disintegration of adherens junctions. Clusters of junctional components and bundles of actin were seen at the basal surface already within 30 min after Src activation. p120ctn was the only component of adherens junction whose relocation correlated to its phosphorylation. Inhibition of Src by a specific inhibitor PP2 restored the cubic morphology of the cells and accumulated cadherin back to lateral walls. Still p120ctn remained in cytoplasm and thereby was not responsible for the epithelial phenotype. Activation of Rac GTPase by Tiam1 also increased the amount of cadherin at lateral membranes and maintained the morphology of src-MDCK cells practically normal after activation of Src kinase. In the same way, actin cytoskeleton was reorganised in gastric carcinoma cells in response to infection with H. pylori via activation of Rac signalling pathway. Hence, Rac and cadherin seem to be the major players in the maintenance of epithelial cell morphology.

Les protéines DOCK180 et ELMO coopèrent ensemble biochimiquement et génétiquement afin d’activer la GTPase Rac1 lors de plusieurs évènements biologiques. Toutefois, le rôle que jouent ces protéines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous émettons l’hypothèse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour l’intégration de la signalisation de Rac plutôt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de façon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protéine d’échafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans l’objectif nº 1, nous démontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site d’interaction principal entre cette protéine et DOCK180. De plus, nous démontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 n’est pas nécessaire pour l’activation de Rac, mais est plutôt essentielle pour faciliter la réorganisation du cytosquelette induite par l’activation de Rac en aval de Dock180. Ces résultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rôles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans l’objectif nº 2, nous avons découvert l’existence d’une homologie structurelle entre ELMO et un module d’autorégulation de la formine Dia1, et avons identifié trois nouveaux domaines dans la protéine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De façon analogue à Dia1, nous avons découvert que ELMO à l’état basal est autoinhibé grâce à des intéractions intramoléculaires. Nous proposons que l’état d’activation des protéines ELMO est régulé de façon similaire aux formines de la famille Dia, c’est-à-dire grâce à des interactions avec d’autres protéines. Dans l’objectif nº 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possède une double spécificité pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons découvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos résultats nous permettent de supposer que d’autres GTPases pourraient être impliquées dans l’activation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu’à l’état basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibée. Bien que le mécanisme d’activation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons découvert que, lorsqu’il y a stimulation cellulaire, certaines GTPases liées au GTP peuvent intéragir avec le domaine RBD de ELMO pour relâcher les contacts intramoléculaires et/ou localiser le complexe à la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir d’ancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de l’activation et de la signalisation de Rac. / DOCK180 and ELMO cooperate biochemically and genetically to activate Rac in several biological events. However, the role of these proteins in Rac signaling is still poorly understood. We hypothesize that DOCK180 functions as a RacGEF, with ELMO binding to DOCK180 being required for integration of proper Rac signaling rather than Rac activation per se. We postulate that ELMO acts as a subcellular targeting signal for spatio-temporal restriction of DOCK180-mediated Rac signaling and/or as a scaffold for Rac effectors to enforce cell migration. In Aim #1, we elucidate that the atypical ELMO1 PH is the major DOCK180 binding site. We demonstrate that the binding of ELMO1 to DOCK180 is not necessary for Rac GTP-loading, but is instead required to facilitate Rac-GTP induced cytoskeletal changes following DOCK180 activation. These results imply additional roles for ELMO in mediating Rac signaling. In Aim #2, we reveal structural homology between ELMO and an autoregulatory module in the formin, Dia1, and identify three novel domains in ELMOs: the RBD, EID and EAD. Analogous to Dia1, we uncovered that ELMO is autoinhibited via intramolecular interactions at basal state. We propose that the activation state of ELMO proteins is regulated, much like in Dia-family formins, via interaction with other proteins. Aim #3 identifies a polyvalent RBD in ELMO with dual specificity for Rho and Arf family GTPases. We found Arl4A as a novel membrane recruitment signal for the ELMO/DOCK180/Rac module. Our results may have broad implications in the activation and localization of this pathway by additional GTPases. We conclude that, at basal levels, ELMO/DOCK180 is complexed, with ELMO in an autoinhibited state in the cytosol. Through cell stimulation, certain GTPases will be activated that now bind the ELMO RBD and alleviate the intramolecular contacts. In this way, the GTPase anchors the activated ELMO/DOCK180 module in place for proper spatio-temporal regulation of Rac activation and signaling.

Les protéines DOCK180 et ELMO coopèrent ensemble biochimiquement et génétiquement afin d’activer la GTPase Rac1 lors de plusieurs évènements biologiques. Toutefois, le rôle que jouent ces protéines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous émettons l’hypothèse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour l’intégration de la signalisation de Rac plutôt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de façon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protéine d’échafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans l’objectif nº 1, nous démontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site d’interaction principal entre cette protéine et DOCK180. De plus, nous démontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 n’est pas nécessaire pour l’activation de Rac, mais est plutôt essentielle pour faciliter la réorganisation du cytosquelette induite par l’activation de Rac en aval de Dock180. Ces résultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rôles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans l’objectif nº 2, nous avons découvert l’existence d’une homologie structurelle entre ELMO et un module d’autorégulation de la formine Dia1, et avons identifié trois nouveaux domaines dans la protéine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De façon analogue à Dia1, nous avons découvert que ELMO à l’état basal est autoinhibé grâce à des intéractions intramoléculaires. Nous proposons que l’état d’activation des protéines ELMO est régulé de façon similaire aux formines de la famille Dia, c’est-à-dire grâce à des interactions avec d’autres protéines. Dans l’objectif nº 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possède une double spécificité pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons découvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos résultats nous permettent de supposer que d’autres GTPases pourraient être impliquées dans l’activation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu’à l’état basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibée. Bien que le mécanisme d’activation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons découvert que, lorsqu’il y a stimulation cellulaire, certaines GTPases liées au GTP peuvent intéragir avec le domaine RBD de ELMO pour relâcher les contacts intramoléculaires et/ou localiser le complexe à la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir d’ancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de l’activation et de la signalisation de Rac. / DOCK180 and ELMO cooperate biochemically and genetically to activate Rac in several biological events. However, the role of these proteins in Rac signaling is still poorly understood. We hypothesize that DOCK180 functions as a RacGEF, with ELMO binding to DOCK180 being required for integration of proper Rac signaling rather than Rac activation per se. We postulate that ELMO acts as a subcellular targeting signal for spatio-temporal restriction of DOCK180-mediated Rac signaling and/or as a scaffold for Rac effectors to enforce cell migration. In Aim #1, we elucidate that the atypical ELMO1 PH is the major DOCK180 binding site. We demonstrate that the binding of ELMO1 to DOCK180 is not necessary for Rac GTP-loading, but is instead required to facilitate Rac-GTP induced cytoskeletal changes following DOCK180 activation. These results imply additional roles for ELMO in mediating Rac signaling. In Aim #2, we reveal structural homology between ELMO and an autoregulatory module in the formin, Dia1, and identify three novel domains in ELMOs: the RBD, EID and EAD. Analogous to Dia1, we uncovered that ELMO is autoinhibited via intramolecular interactions at basal state. We propose that the activation state of ELMO proteins is regulated, much like in Dia-family formins, via interaction with other proteins. Aim #3 identifies a polyvalent RBD in ELMO with dual specificity for Rho and Arf family GTPases. We found Arl4A as a novel membrane recruitment signal for the ELMO/DOCK180/Rac module. Our results may have broad implications in the activation and localization of this pathway by additional GTPases. We conclude that, at basal levels, ELMO/DOCK180 is complexed, with ELMO in an autoinhibited state in the cytosol. Through cell stimulation, certain GTPases will be activated that now bind the ELMO RBD and alleviate the intramolecular contacts. In this way, the GTPase anchors the activated ELMO/DOCK180 module in place for proper spatio-temporal regulation of Rac activation and signaling.

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