Mon travail de thèse a été entièrement dévoué à l’étude d’une récente technique d’ionisation en spectrométrie de masse : la photoionisation à pression atmosphérique (APPI). Ce travail est développé sur deux axes principaux. D’une part, il vise à appliquer cette méthode d’ionisation à de nouvelles familles de molécules et d’en élargir le cas échéant le domaine d’application. D’autre part et parallèlement à cela, nous nous sommes attachés à l’étude des mécanismes de formation des ions ainsi qu’à l’élucidation des voies de fragmentation. En effet, ces dernières se révèlent souvent intensives et particulières. Les résultats obtenus dans le cadre du premier axe de recherche de ce travail de thèse offrent de nouvelles solutions pour mieux comprendre le comportement de molécules biologiques sous irradiation UV et à pression atmosphérique. En effet, nous avons pu démontrer que la photoionisation à pression atmosphérique pouvait s’étendre à d’autres classes de composés que ceux initialement pressentis et plus particulièrement à des biomolécules polaires et de haut poids moléculaire tels que les acides nucléiques, peptides, les peptides, etc. De plus, ce travail a permis de démontrer l’impact du milieu (solvant) sur le mécanisme de formation des ions sous irradiation UV. Ainsi l’étude et la connaissance des mécanismes fondamentaux de formation des ions en APPI a visé in fine au contrôle de la formation des ions précurseurs et par voie de conséquence, à celui des fragments générés en source. Nous avons observé des ions fragments radicalaires d’un type nouveau, jamais observé auparavant avec les sources d’ions connues L’originalité et le caractère résolument novateur de cette expérience nous ont amené à transférer cette expérience sur une ligne de lumière du Synchrotron SOLEIL. L’utilisation d’une source de lumière accordable en APPI va certainement renforcer la versatilité de cette source d’ions. / My PhD’s work has been completely dedicated to develop new ionization source in mass spectrometry: the atmospheric pressure photoionization (APPI). This work is developed on two main areas. On the one hand, it aims to apply this method to new family of biomolecules. On the other hand, we report a comprehensive study on the ionization mechanisms in APPI. The first part of this manuscript offers a better understanding of the behaviour of the biological molecules under VUV radiation and atmospheric pressure. Indeed, we were able to say that polar and high molecular weight biomolecules could be easily photoionizable. Moreover, this work allows studying the effect of the medium (solvent) on the photoionization mechanism to be studied. It is possible to control the orientation of the observed reactions and to choose a particular type of molecular ion. We observed extensive and peculiar fragmentations which have never been detected with classical ionization techniques. The originality and innovative approach of this experience led us to transfer it to a UV beamline of the Synchrotron SOLEIL. Using an accordable source will certainly enhance the versatility of the ion source.