Os PPARs são fatores de transcrição ativados por ligantes, pertencentes à superfamília dos receptores nucleares, que são considerados sensores de lipídeos capazes de transformar alterações nos padrões de lipídeos/ácidos graxos dos organismos em atividade metabólica. Com isto, os 3 isotipos (α, δ e γ) estão associados a diferentes desordens metabólicas como doenças vasculares, diabetes, obesidade, câncer e certas doenças mentais que constituem um grave problema de saúde pública mundial, o que torna esta classe de proteínas, um valioso alvo para a indústria farmacêutica. Embora a importância do hPPARδ na regulação da transcrição de genes relacionados a uma série de processos metabólicos seja conhecida, não há ainda nenhum fármaco no mercado cujo alvo seja este receptor. O maior conhecimento a respeito da estrutura deste receptor pode trazer esclarecimentos capazes de auxiliar o desenvolvimento racional de fármacos. Desta forma, no presente trabalho, buscou-se encontrar características estruturais importantes para a seletividade e especificidade dos ligantes pelo isotipo δ. Para tal, determinou-se as condições de expressão e purificação da proteína hPPARδ LBD, bem como as condições apropriadas de manutenção da mesma por meio da técnica de dicroísmo circular. O estado oligomérico deste receptor foi determinado em solução através das técnicas de cromatografia por exclusão de tamanho e por espalhamento dinâmico de luz, onde se concluiu que a proteína é monomérica nas condições testadas. Além disto, através de uma estrutura de alta resolução da proteína hPPARδ LBD com o ligante GW 0742, propôs-se a construção de dois mutantes, V312M e I328M, através dos quais concluiu-se que estes dois resíduos são potencialmente importantes para interação de ligantes estruturalmente relacionados com GW 0742, ao isotipo δ, indicando dois determinantes relacionados à seletividade de ligantes por este isotipo. Como existem poucos relatos sobre a estrutura completa deste receptor, e consequentemente da influência que os domínios N-terminal e DBD apresentam sobre o domínio LBD, um breve estudo da interação diferencial entre o receptor nuclear hPPARδ Full e três diferentes cofatores, em presença de ligante agonista e antagonista foi realizado. Para isto, determinou-se as condições de expressão e purificação da proteína hPPARδ Full, e prosseguiu-se com ensaios de anisotropia de fluorescência, através dos quais ficou claro que cada cofator apresenta um padrão diferente de interação com a proteína que pode ser dependente de outras regiões da proteína além daquelas já classicamente descritas. Isto é um forte indicativo de que diferentes regiões do hPPARδ podem ser chave no processo de regulação por intermédio de cofatores. / PPARs are transcription factors activated by ligands, belonging to the superfamily of nuclear receptors, which are considered to be lipid sensors capable of making changes in patterns of lipid/fatty acid metabolic activity of organisms. The three isotypes (α, δ and γ) are associated with different metabolic disorders and vascular diseases as diabetes, obesity, cancer and certain mental illnesses which comprise a serious worldwide public health problem, making this class of proteins a valuable target for the pharmaceutical industry. Although it is known the importance of hPPARδ in regulating transcription of genes related to a series of metabolic processes, there is still no drug on the market directed to this receptor. Knowledge about the structure of this receptor can bring clarification able to assist the rational development of drugs. Therefore, in the present study, we sought to find structural features important for selectivity and specificity of ligand binding by the isotype δ. To this end, we determined the conditions of expression and purification of the protein hPPARδ LBD, as well as the appropriate conditions for maintaining it through the technique of circular dichroism. The oligomeric state of this receptor in solution was determined through the techniques of size exclusion chromatography and dynamic light scattering, which concluded that the protein is monomeric under the conditions tested. In addition, through a high-resolution structure of the protein hPPARδ LBD with the ligand GW 0742, we proposed the construction of two mutants, V312M and I328M, through which it was concluded that these two residues are potentially important for interaction of ligands structurally related to GW 0742 with the δ isotype. As there are few reports based on the complete structure of this receptor, and consequently about the influence of the N-terminal and DBD domains with the LBD domain, a brief study of the interaction between the nuclear receptor differential hPPARδ Full and three different cofactors in the presence of agonist and antagonist ligands were performed. For this, we determined the conditions of expression and purification of the protein hPPARδ Full, and using fluorescence anisotropy, it became clear that each cofactor has a different pattern of interaction with the protein which may be dependent on other regions of the protein in addition to those already described classically. This is a strong indication that different regions of hPPARδ can be key points in the regulatory process through cofactors.

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Campus access only. Vita. Bibliography: 176-188.

Os PPARs são fatores de transcrição ativados por ligantes, pertencentes à superfamília dos receptores nucleares, que são considerados sensores de lipídeos capazes de transformar alterações nos padrões de lipídeos/ácidos graxos dos organismos em atividade metabólica. Com isto, os 3 isotipos (α, δ e γ) estão associados a diferentes desordens metabólicas como doenças vasculares, diabetes, obesidade, câncer e certas doenças mentais que constituem um grave problema de saúde pública mundial, o que torna esta classe de proteínas, um valioso alvo para a indústria farmacêutica. Embora a importância do hPPARδ na regulação da transcrição de genes relacionados a uma série de processos metabólicos seja conhecida, não há ainda nenhum fármaco no mercado cujo alvo seja este receptor. O maior conhecimento a respeito da estrutura deste receptor pode trazer esclarecimentos capazes de auxiliar o desenvolvimento racional de fármacos. Desta forma, no presente trabalho, buscou-se encontrar características estruturais importantes para a seletividade e especificidade dos ligantes pelo isotipo δ. Para tal, determinou-se as condições de expressão e purificação da proteína hPPARδ LBD, bem como as condições apropriadas de manutenção da mesma por meio da técnica de dicroísmo circular. O estado oligomérico deste receptor foi determinado em solução através das técnicas de cromatografia por exclusão de tamanho e por espalhamento dinâmico de luz, onde se concluiu que a proteína é monomérica nas condições testadas. Além disto, através de uma estrutura de alta resolução da proteína hPPARδ LBD com o ligante GW 0742, propôs-se a construção de dois mutantes, V312M e I328M, através dos quais concluiu-se que estes dois resíduos são potencialmente importantes para interação de ligantes estruturalmente relacionados com GW 0742, ao isotipo δ, indicando dois determinantes relacionados à seletividade de ligantes por este isotipo. Como existem poucos relatos sobre a estrutura completa deste receptor, e consequentemente da influência que os domínios N-terminal e DBD apresentam sobre o domínio LBD, um breve estudo da interação diferencial entre o receptor nuclear hPPARδ Full e três diferentes cofatores, em presença de ligante agonista e antagonista foi realizado. Para isto, determinou-se as condições de expressão e purificação da proteína hPPARδ Full, e prosseguiu-se com ensaios de anisotropia de fluorescência, através dos quais ficou claro que cada cofator apresenta um padrão diferente de interação com a proteína que pode ser dependente de outras regiões da proteína além daquelas já classicamente descritas. Isto é um forte indicativo de que diferentes regiões do hPPARδ podem ser chave no processo de regulação por intermédio de cofatores. / PPARs are transcription factors activated by ligands, belonging to the superfamily of nuclear receptors, which are considered to be lipid sensors capable of making changes in patterns of lipid/fatty acid metabolic activity of organisms. The three isotypes (α, δ and γ) are associated with different metabolic disorders and vascular diseases as diabetes, obesity, cancer and certain mental illnesses which comprise a serious worldwide public health problem, making this class of proteins a valuable target for the pharmaceutical industry. Although it is known the importance of hPPARδ in regulating transcription of genes related to a series of metabolic processes, there is still no drug on the market directed to this receptor. Knowledge about the structure of this receptor can bring clarification able to assist the rational development of drugs. Therefore, in the present study, we sought to find structural features important for selectivity and specificity of ligand binding by the isotype δ. To this end, we determined the conditions of expression and purification of the protein hPPARδ LBD, as well as the appropriate conditions for maintaining it through the technique of circular dichroism. The oligomeric state of this receptor in solution was determined through the techniques of size exclusion chromatography and dynamic light scattering, which concluded that the protein is monomeric under the conditions tested. In addition, through a high-resolution structure of the protein hPPARδ LBD with the ligand GW 0742, we proposed the construction of two mutants, V312M and I328M, through which it was concluded that these two residues are potentially important for interaction of ligands structurally related to GW 0742 with the δ isotype. As there are few reports based on the complete structure of this receptor, and consequently about the influence of the N-terminal and DBD domains with the LBD domain, a brief study of the interaction between the nuclear receptor differential hPPARδ Full and three different cofactors in the presence of agonist and antagonist ligands were performed. For this, we determined the conditions of expression and purification of the protein hPPARδ Full, and using fluorescence anisotropy, it became clear that each cofactor has a different pattern of interaction with the protein which may be dependent on other regions of the protein in addition to those already described classically. This is a strong indication that different regions of hPPARδ can be key points in the regulatory process through cofactors.

The eukaryotic interphase nucleus is well organised and the genome positioned non-randomly. Nuclear structure is an important regulator of genome behaviour and function. Genome organisation and nuclear structure are compromised in diseases such as cancer and laminopathies. This study was to find out and to determine if there is any functional relationship between nuclear structure and genome mis-organisation in cancer cells. I have assessed the presence and distribution of specific nuclear structural proteins (A-type, B-type lamins and its receptor LBR, many of their binding proteins such as MAN1, LAP2α, LAP2, and Emerin and other nuclear proteins (PML, Nucleolin, and Ki67) using indirect immunofluorescence. From this study, it is found that the nuclear structure of breast cancer cells is often altered. The most severely affected proteins are the nuclear lamins B1 and B2 and they found as large foci within the nucleoplasm with little LBR expression to localise the lamin B. I also assessed the chromosome positioning (HSA 7, 10, 11, 14 and 17) and gene positioning (AKT1, CCND1, HSP90AA1, EGFR, ERRBB2/HER2 and PTEN) in breast cancer cell lines (T-47D, GI-101, Sk-Br-3 and BT-474) and in normal breast cell lines (MCF-10A) using 2D-FISH technique. I also assessed the position of the genes in nuclei and correlated with gene expression using qRT-PCR. Breast cell lines have treated with a drug named lovastatin and it was found that the cells have restored LBR expression and localisation of lamin B, leading to altered gene positioning and changed expression of breast cancer genes. Since the drug (lovastatin, 12 μM/48 hours) affects the prenylation as a post-translation modification process and lamins B biosythensis, it is found that B-type lamins and its receptor expression and distribution were improved and increased in expression by 2-fold in expression levels in the most affected cells (T-47D, and BT-474) compared to the normal cells (MCF-10A) and these cells also showed abnormal nuclei and dead cells. When analysing the nuclear positioning of the genes (AKT1, HSP90AA1 and ERRBB2/HER2), it is found that AKT1 was positioned periphery in BT-474 and T-47D cells and interiorly in the normal cells (MCF-10A) before treatment whereas the same gene was positioned periphery in T-47D and MCF-10A cells and interiorly in BT-474 after treatment with lovastatin. It is also found that HSP90AA1 was positioned periphery in MCF-10A and T-47D cells and interiorly in BT-474 cells before and after treatment (no change). Moreover, ERRBB2/HER2 gene was positioned periphery in T-47D and BT-474 cells and interiorly in MCF-10A cells before treatment whereas the same gene was positioned periphery in MCF-10A and T-47D cells and interiorly in BT-474 after treatment with the same drug. Regarding LMNB1, LMNB2, and LBR genes, the study focussed only on their expression levels and no work has done on their chromosome positioning as well as gene position before and after treatment. These three genes were over expressed when assessed by measuring the relative and fold changes in expression. Therefore, it is suggestive that 2D-FISH experiment to assess their localisation and their specific chromosome territories is required. The results shown in this thesis demonstrate the importance and roles of nuclear architecture specifically nuclear lamins and the integral nuclear membrane proteins (B-type lamins and LBR) in mediating correct genome organisation and function. The breast normal (immortalised cells) and cancerous cell lines showed different nuclear structures as lamin B affect the position of specific target chromosomes and genes. These results will strength the finding that the nuclear lamina is a significant nuclear structure which associates, organises, and regulates numerous vital nuclear processes and the stability of the genome.

Os receptores nucleares são de suma importância para os processos de sinalização intercelular nos eucariotos, uma vez que possuem a capacidade de convergir diferentes sinais internos e externos na regulação de programas genéticos. Estas proteínas funcionam, na sua maioria, como fatores de transcrição ativados por ligantes, sendo a via de comunicação direta entre as moléculas de sinalização e a resposta transcricional eliciada pelas mesmas. A programação genética, estabilizada ou modificada pelos receptores, afeta virtualmente todos os aspectos da vida dos organismos multicelulares, tais como a embriogênese, a homeostase, a reprodução, o crescimento e a morte celular. A regulação transcricional e a seletividade promovida por estas proteínas têm fomentado intensas pesquisas, as quais estão decifrando a complexa rede de eventos moleculares que relatam sua forma de ação. Será um desafio para o futuro o conhecimento completo das regras moleculares que definem sua maneira de promover o controle espacial e temporal da expressão gênica. Estas informações prometem trazer detalhes cruciais para o desenvolvimento de drogas mais eficientes e de grande valor terapêutico. Neste contexto, o principal objetivo dos estudos aqui apresentados foi o de aumentar o conhecimento sobre o comportamento e estrutura do receptor nuclear humano dos hormônios tireoidianos, isoforma β1 (hTRβ1), e do receptor nuclear humano do ácido retinóico 9-cis, isoforma ? (hRXRα). Para tal, aplicou-se a técnica de espalhamento de raios X a baixos ângulos para determinar-se, em solução, o envelope destes receptores contendo os domínios de ligação ao DNA e ao ligante. Paralelamente, investiu-se em diversas tentativas de cristalização dos mesmos. Os resultados obtidos permitiram a determinação da localização espacial dos diferentes domínios e as organizações quaternárias dos homodímeros e homotetrâmeros. Conseqüentemente, foram propostos os primeiros modelos estruturais de receptores nucleares contendo os domínios de ligação ao DNA e ao ligante. O comportamento oligomérico, em solução, do hTRβ1 também foi analisado qualitativamente. Verificou-se que a formação do homodímero e do homotetrâmero é influenciada pela presença do hormônio T3, pela concentração protéica, pelos domínios presentes e por mutações específicas. Estes estudos geraram a hipótese de que o receptor nuclear hTRβ1 é capaz de se autoreprimir. Até então, dentro da superfamília dos receptores nucleares, esta capacidade de autorepressão somente havia sido descrita para o receptor hRXRα. Por fim, cristalizou-se o domínio LBD do receptor hTRβ1 com os ligantes T3, Triac e GC-1. O objetivo foi o de determinar estruturas cristalográficas importantes para o futuro desenvolvimento de tiromiméticos de ação isoforma-seletiva. / In eukaryotes, nuclear receptors are of major importance for intercellular signaling because they join different intra and extracellular signals during regulation of genetic programs. The great majority of these proteins function as ligand activated transcription factors providing a direct link between signaling molecules and the transcriptional responses elicited by them. The genetic programs that these receptors establish or modify affect virtually all aspects of the multicellular organisms? life, such as embryogenesis, homeostasis, reproduction, cell growth, and death. Their gene-regulatory power and selectivity has prompted intense research which is now starting to decipher the complex network of molecular events involved in transcription regulation. The future challenge will be to uncover the molecular rules that define spatial and temporal control of gene expression. Such knowledge would be essential to the development of more efficient drugs with better therapeutic values. Therefore, the main purpose in this study was to extend the understanding on the behavior and the structure of human thyroid receptor, isoform ?1 (hTRβ1), and human retinoic acid X receptor, isoform ? (hRXRα). It was applied the small angle X-ray scattering technique to determine, in solution, the envelop of both receptors containing DNA and ligand binding domains. Beside this, several crystallization conditions were tried for both receptors. The results made possible to define the spatial localization of the domains and the quaternary structure of the homodimers and homotetramers. Consequently, we were able to propose the first structural models for nuclear receptors containing the DNA and ligand binding domains. The oligomeric behavior of the hTRβ1, in solution, was also analyzed qualitatively. We verified that it was influenced by the presence of T3 hormone, the protein concentration, the presence of both DNA and ligand binding domains, and by specific mutations. Based on these results, we were able to hypothesize that the hTRβ1 has the capacity of autorepression. Up to now, only the hRXRα, in the whole nuclear receptor superfamily, had been described to behave similarly. Finally, we crystallized the ligand binding domain of the hTRβ1 in the presence of the ligands T3, Triac, and GC-1. The objective was to solve crystallographic structures essential for the future development of tiromimetics with isoform-selective action.

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2009. / Title from PDF title page (viewed on Sept. 4, 2009). Includes bibliographical references.

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-03-16T13:45:25Z No. of bitstreams: 1 PGCA17MA219.pdf: 853811 bytes, checksum: 5ed849be56df67865d9463e92b006618 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-16T13:45:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA17MA219.pdf: 853811 bytes, checksum: 5ed849be56df67865d9463e92b006618 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Capes / The search for optimization of production systems with animals leads to besides the animal fator, and show us that the micro components are the ones which sustain the production factores. On this way the nutrigenomic animal gains more importance and prominent in the search forresourse efficiency. Thereby the aim of this work was to analyse the effects of peroxisome proliferator activated gamma receptors (PPARγ) in the transcription of lipogenic genes and its response to conjugated linoleic acid (mixture of isomers trans-10, cis12 and cis-9, trans-11) through a specific chemical agonist (TZD, thiazolinedione). 1) Control: growing medium, 400μl; 2) TZD: 40ml (10μMol/Lt); 3) CLA (50% of CLA trans10, cis-12 and 50% of CLA cis-9, trans-11): 30ml (315μMol/Lt) and 4) TZD+CLA: 40ml TZD (10μMol/Lt) + 30ml (315μMol/Lt). It was extracted the RNA, synthesized the complementary DNA (cDNA), and carried out the polimerase chain reaction in Real Time (PCR – Real Time), measured the genetic expression of isoform PIII of acetyl-CoA-carboxylase alpha (ACCα), fatty acid synthase (FASN), peroxisome proliferator activated gamma receptors (PPARγ), sterol regulatory elemento-binding protein 1 (SREBP1), cleavage activation protein of SREBP1 (SCAP), stearoyl-CoA-desaturase (SCD), insulin induced gene 1(INSIG1), insulin induced gene 2(INSIG2). Compared to control, the treatment TZD increased the genes expression being SREBP1(1010%), INSIG1 (789%), INSIG2 (849%), FASN (7831%), ACCα (8753%), SCD (6272%) and PPARγ (620%). Compared to the TZD+CLA treatment, the TZD treatment increased the expression of the genes SREBP1 (237%), ACCα (1729%), INSIG1 (7142%) and PPARγ (2480%). Compared to CLA treatment, TZD increased the expression of FASN (275%), SCAP (916%), SCD (206%) and INSIG2 (1700%). It was concluded that the use of chemical agonist TZD in explants of the mammary gland of ewes, grown in vitro has acted to induce a greater expression of PPARγ and CLA reduces the genes expression FASN, ACCα, SCD and SCAP. In the TZD+CLA treatment, the TZD does not exceed the capacity of reducing CLA gene expression for the PPARγ, FASN, SCD, SCAP, INSIG1 and INSIG2 / A busca pela otimização dos sistemas produtivos com animais conduz para além do fator animal, e nos mostram que os componentes “micro” são que sustentam os fatores de produção. Deste modo a nutrigenômica animal ganha cada vez mais importância e destaque na busca pela eficiência de recursos. Com isso, o presente trabalho visou analisar o efeito dos receptores ativados por proliferadores de peroxissomo gama (PPARγ) na transcrição de genes lipogênicos e sua resposta ao ácido linoleico conjugado (CLA, com os isômeros trans-10, cis-12 e cis-9, trans-11), através de um agonista químico específico (TZD, thiazolinediona). No experimento foram realizados cultivos de explantes de glândula mamária de ovelhas lactantes, submetidos aos seguintes tratamentos: 1) Controle: meio de cultivo, 400μl; 2) TZD: 40mL (10 μMol/Lt); 3) CLA: (50% de trans-10, cis-12 e 50% de cis-9, trans-11): 30mL (315 μMol/Lt) e; 4) TZD + CLA: 40mL TZD (10 μMol/Lt) + 30mL (315 μMol/Lt). Foi extraído o RNA, sintetizado o DNA complementar (cDNA) e realizado a reação da cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real Time) e medida a expressão gênica da isoforma PIII da acetil-CoA-carboxilase alfa (ACCα), ácido graxo sintase (FASN), receptores ativados por proliferadores de peroxissomo gama (PPARγ), proteína de ligação ao elemento de resposta a esterol 1 (SREBP1), proteína de ativação de clivagem da SREBP1 (SCAP), estearoil-CoA-dessaturase (SCD), gene-1 induzido pela insulina (INSIG1), gene-2 induzido pela insulina (INSIG2). Comparado ao Controle, o TZD aumentou a expressão dos genes, sendo SREBP1 (1.010%), INSIG1 (789%), INSIG2 (849%), FASN (7831%), ACCα (8753%), SCD (6272%) e PPARγ (620%). Comparado ao tratamento TZD+CLA o TZD, aumentou a expressão dos genes SREBP1 (237%), ACCα (1729%), INSIG1 (7142%) e PPARγ (2480%). Em comparação ao tratamento CLA, o TZD aumentou a expressão da FASN (275%), SCAP (916%), SCD (206%) e INSIG2 (1700%). Conclui-se que o uso do agonista químico TZD em explantes da glândula mamária de ovelhas lactantes aumenta a expressão do PPARγ e o CLA reduz a expressão gênica da FASN, ACCα, SCD e SCAP. No tratamento TZD+CLA, o TZD não supera a capacidade de redução da expressão gênica do CLA para os genes PPARγ, FASN, SCD, SCAP, INSIG1 e INSIG2

Os receptores nucleares são de suma importância para os processos de sinalização intercelular nos eucariotos, uma vez que possuem a capacidade de convergir diferentes sinais internos e externos na regulação de programas genéticos. Estas proteínas funcionam, na sua maioria, como fatores de transcrição ativados por ligantes, sendo a via de comunicação direta entre as moléculas de sinalização e a resposta transcricional eliciada pelas mesmas. A programação genética, estabilizada ou modificada pelos receptores, afeta virtualmente todos os aspectos da vida dos organismos multicelulares, tais como a embriogênese, a homeostase, a reprodução, o crescimento e a morte celular. A regulação transcricional e a seletividade promovida por estas proteínas têm fomentado intensas pesquisas, as quais estão decifrando a complexa rede de eventos moleculares que relatam sua forma de ação. Será um desafio para o futuro o conhecimento completo das regras moleculares que definem sua maneira de promover o controle espacial e temporal da expressão gênica. Estas informações prometem trazer detalhes cruciais para o desenvolvimento de drogas mais eficientes e de grande valor terapêutico. Neste contexto, o principal objetivo dos estudos aqui apresentados foi o de aumentar o conhecimento sobre o comportamento e estrutura do receptor nuclear humano dos hormônios tireoidianos, isoforma β1 (hTRβ1), e do receptor nuclear humano do ácido retinóico 9-cis, isoforma ? (hRXRα). Para tal, aplicou-se a técnica de espalhamento de raios X a baixos ângulos para determinar-se, em solução, o envelope destes receptores contendo os domínios de ligação ao DNA e ao ligante. Paralelamente, investiu-se em diversas tentativas de cristalização dos mesmos. Os resultados obtidos permitiram a determinação da localização espacial dos diferentes domínios e as organizações quaternárias dos homodímeros e homotetrâmeros. Conseqüentemente, foram propostos os primeiros modelos estruturais de receptores nucleares contendo os domínios de ligação ao DNA e ao ligante. O comportamento oligomérico, em solução, do hTRβ1 também foi analisado qualitativamente. Verificou-se que a formação do homodímero e do homotetrâmero é influenciada pela presença do hormônio T3, pela concentração protéica, pelos domínios presentes e por mutações específicas. Estes estudos geraram a hipótese de que o receptor nuclear hTRβ1 é capaz de se autoreprimir. Até então, dentro da superfamília dos receptores nucleares, esta capacidade de autorepressão somente havia sido descrita para o receptor hRXRα. Por fim, cristalizou-se o domínio LBD do receptor hTRβ1 com os ligantes T3, Triac e GC-1. O objetivo foi o de determinar estruturas cristalográficas importantes para o futuro desenvolvimento de tiromiméticos de ação isoforma-seletiva. / In eukaryotes, nuclear receptors are of major importance for intercellular signaling because they join different intra and extracellular signals during regulation of genetic programs. The great majority of these proteins function as ligand activated transcription factors providing a direct link between signaling molecules and the transcriptional responses elicited by them. The genetic programs that these receptors establish or modify affect virtually all aspects of the multicellular organisms? life, such as embryogenesis, homeostasis, reproduction, cell growth, and death. Their gene-regulatory power and selectivity has prompted intense research which is now starting to decipher the complex network of molecular events involved in transcription regulation. The future challenge will be to uncover the molecular rules that define spatial and temporal control of gene expression. Such knowledge would be essential to the development of more efficient drugs with better therapeutic values. Therefore, the main purpose in this study was to extend the understanding on the behavior and the structure of human thyroid receptor, isoform ?1 (hTRβ1), and human retinoic acid X receptor, isoform ? (hRXRα). It was applied the small angle X-ray scattering technique to determine, in solution, the envelop of both receptors containing DNA and ligand binding domains. Beside this, several crystallization conditions were tried for both receptors. The results made possible to define the spatial localization of the domains and the quaternary structure of the homodimers and homotetramers. Consequently, we were able to propose the first structural models for nuclear receptors containing the DNA and ligand binding domains. The oligomeric behavior of the hTRβ1, in solution, was also analyzed qualitatively. We verified that it was influenced by the presence of T3 hormone, the protein concentration, the presence of both DNA and ligand binding domains, and by specific mutations. Based on these results, we were able to hypothesize that the hTRβ1 has the capacity of autorepression. Up to now, only the hRXRα, in the whole nuclear receptor superfamily, had been described to behave similarly. Finally, we crystallized the ligand binding domain of the hTRβ1 in the presence of the ligands T3, Triac, and GC-1. The objective was to solve crystallographic structures essential for the future development of tiromimetics with isoform-selective action.

Orientador: Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daSilva_JulioCesarAraujo_D.pdf: 43361733 bytes, checksum: 212cdef85174d1daf286133ff839cfb2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Receptores de androgênio (AR) são membros da superfamília de receptores nucleares que incluem os receptores de esteroides, entre outros. O AR liga os esteroides sexuais endógenos diidrotestosterona e testosterona. O desenvolvimento normal do fenótipo masculino e do sistema reprodutivo necessita de ações pré- e pósnatais promovidas pela interação do AR com esses hormônios. Mutações no gene do receptor de androgênio podem levar a várias doenças como o câncer de próstata e a síndrome de insensibilidade ao androgênio (AIS). Substituições diferentes no mesmo resíduo de aminoácido podem resultar em impactos variáveis na atividade do receptor levando a diferentes graus de AIS. Um grande número de mutações tem sido reportado para o AR envolvendo AIS e células tumorais de câncer de próstata e sua localização e função podem ajudar a entender como essas doenças devem ser tratadas. Entretanto, pouco se sabe sobre como as mutações mudam a estrutura e a dinâmica do AR, uma vez que apenas poucas estruturas cristalográficas de mutantes foram obtidas. Neste trabalho, apresentamos estudos de simulação de dinâmica molecular de algumas estruturas do AR humano com mutações localizadas no domínio de ligação do ligante (LBD) em comparação com a estrutura nativa complexadas com o ligante sintético metiltrienolona (R1881). Nosso objetivo é investigar as bases moleculares das mudanças sutis no receptor causadas pelas mutações que afetam sua afinidade pelo ligante R1881. Embora nenhum dos resíduos mutados deste estudo interajam diretamente com o ligante, os resultados das simulações indicaram que as mutações causam mudanças estruturais e dinâmicas no AR-LBD na região onde se localiza a mutação e na cavidade de ligação do ligante (LBP). A principal mudança observada foi o deslocamento do resíduo Arg752, facilitando a entrada de moléculas de água no LBP e o reposicionamento de cadeias laterais dos resíduos do domínio F, uma importante região que contribui para a estabilidade da estrutura do AR-LBD e da conformação ativa da hélice 12. Os resultados obtidos mostram que essas mutações, que ocorrem naturalmente, são exemplos de resíduos que não estão em contato direto com o ligante e não pertencem à região de recrutamento do coativador, mas que possuem um importante papel na ligação do ligante e na ativação do receptor por estabilizar a hélice 12 e o domínio F na conformação ativa / Abstract: Androgen receptors (AR) are members of the superfamily of nuclear receptors that includes the steroid receptors, among others. AR binds the male endogenous sex steroids, dihydrotestosterone and testosterone. Normal development of the male phenotype and reproductive system requires pre- and postnatal actions promoted by AR interaction with these hormones. Mutations in the androgen receptor gene may lead to several diseases like prostate cancer (PCa) and the androgen insensitivity syndrome (AIS). Different substitutions at the same amino acid residue may result in variable impact on the activity of the receptor leading to different degrees of AIS. A number of mutations have been reported for the AR in AIS and PCa tumor cells and their location and function may help us to understand how these diseases should be treated. Nevertheless, not much is known about how the mutations change the structure and dynamics of the AR since only a few crystallographic structures of mutants were obtained. In this work we present molecular dynamics simulation (MD) studies of some human AR mutations located in the ligand binding domain (LBD) in comparison with wild type (WT) structure in complex with the synthetic ligand methyltrienolone (R1881). Our goal is to investigate the molecular basis of subtle changes in the receptor caused by mutations in the AR-LBD/R1881 affinity. Although the mutated residues do not interact with the ligand, the simulations results indicated that the mutants cause structural and dynamical changes in the AR-LBD in the region in which the mutation is placed and in the binding pocket (LBP). The principal change observed was the displacement of residue Arg752, facilitating water penetration in LBP, and the repositioning of F-domain side chains, which makes important contributions to the stability of the AR-LBD structure and helix 12 active conformation. The results obtained show that these naturally occurring mutations are examples of residues that are not in contact with the ligand and do not belong to coactivator recruitment region, but which do have an important role in ligand binding and receptor activation by stabilizing the helix H12 and the F-domain in the active conformation / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Receptores ativados da proliferação de peroxissomos (PPAR) são receptores nucleares que regulam o metabolismo de gordura e glicose, adipogênese e polarização de macrófagos, e são os mediadores da ação de uma grande classe de fármacos usada no tratamento de diabetes tipo 2, as tiazolidinadionas (TZD). Enquanto as TZDs reduzem a glicose do sangue e aumentam efetivamente a sensibilidade à insulina, elas podem também apresentar efeitos colaterais como aumento do risco de complicações cardiovasculares, ganho de peso, retenção de fluido e toxicidade hepática. Por causa disso, novos fármacos que possuem respostas mais favoráveis devem ser desenvolvidos, e o mecanismo de ativação do PPAR por ligantes vem sendo intensamente examinado. Para entender a relação entre a ligação de agonistas ao PPAR e a ativação transcricional, pretendíamos primeiramente obter cristais de PPAR-LBD (domínio de ligação ao ligante) humano na forma apo. Porém, surpreendentemente, a análise do sítio de ligação ao ligante revelou a presença de três pequenas moléculas, identificadas como ácidos nonanoicos e octanoicos. Este trabalho reporta a análise da estrutura cristalográfica do PPAR LBD complexado simultaneamente com três ácidos graxos de cadeia média (AGCM), provindos de bactérias (organismo de expressão), localizados no sítio de ligação ao ligante. A análise estrutural e funcional sugere que os AGCM são agonistas parciais que estabilizam a conformação do LBD do PPAR por mecanismo independente da hélice 12. / PPARs (peroxisome proliferator activated receptors) are nuclear receptors that regulate glucose and fat metabolism, adipogenesis and macrophage polarization and mediate actions of a major class of drugs that are used to treat type 2 diabetes, the thiazolidinediones. While TZDs reduce blood glucose and improve insulin sensitivity effectively, they can also exhibit deleterious side effects such as increased cardiovascular risk, weight gain, fluid retention and liver toxicity. Because it is desirable to develop new PPAR drugs with more favorable spectrums of response, mechanisms of PPAR ligand activation have come under intense scrutiny. To understand relationships between PPAR ligand binding and transcriptional activation, we sought to obtain apo human PPAR-LBD (ligand binding domain) crystals that diffract to high resolution. More surprisingly, close analysis of the ligand binding pocket revealed the presence of three small molecules, identified as nonanoic acid and octanoic acid. Here, we report the X-ray structural analysis of the PPAR LBD complexed with three bacterial (expression organism) medium chain fatty acids (MCFAs) that simultaneously occupy the buried ligand binding pocket (LBP). Structural and functional analysis suggests that MCFAs are partial agonists that stabilize PPAR LBD conformation, through a helix 12 independent mechanism.