O diabetes é uma doença crônica que afeta mais de 8% da população mundial. As alterações vasculares estão relacionadas às principais complicações do diabetes. A aldosterona contribui para a disfunção endotelial após a ativação do receptor mineralocorticóide (MR). Recentemente, foi demonstrado que a aldosterona ativa o receptor de estrógeno acoplado à proteína G (GPER). A ativação de GPER está relacionada a efeitos benéficos na vasculatura. Entretanto, ainda não existem estudos em artérias de resistência relacionando aldosterona e GPER e essa interação no diabetes. Dessa forma, o presente estudo testou a hipótese de que a aldosterona ativando receptores GPER promove efeitos benéficos na vasculatura, mas esses efeitos estão diminuídos no diabetes. Os objetivos foram investigar os níveis de expressão de GPER nos animais controle e db/db [camundongos com mutação no receptor de leptina que desenvolvem obesidade e diabetes tipo 2], quais efeitos da aldosterona são mediados por ativação de GPER e quais mecanismos envolvidos nessa ativação e verificar se estão alterados no diabetes. O grupo diabético apresentou maior expressão de GPER, mas não de MR. A aldosterona promoveu aumento da resposta máxima contrátil à fenilefrina (PE) somente no grupo controle, que foi revertido pelo uso do antagonista de GPER, G15. No grupo diabético, a resposta à PE já é aumentada, o uso dos antagonistas de MR e GPER reduziram a resposta da PE. A aldosterona ainda reduziu a potência de relaxamento da acetilcolina (ACh) em ambos os grupos, por ativação de MR. O antagonismo de GPER por G15 promoveu um redução adicional na potência do relaxamento no grupo controle, mas não afetou a resposta do grupo diabético. Esses achados confirmam a hipótese de que GPER exerce um papel benéfico na vasculatura e esse efeito é perdido no diabetes. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos que a aldosterona influencia os danos vasculares no diabetes através da ativação de receptores MR e GPER. / Diabetes is a chronic disease that affects more than 8 % of the world population. Vascular changes are related to the major complications of diabetes. Aldosterone contributes to endothelial dysfunction after activation of the mineralocorticoid receptor (MR). It was recently shown that aldosterone also activates the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) and induces non genomic effects. The activation of GPER by estrogen or G1 is related to beneficial effects on the vasculature. However, there are no studies demonstrating the relationship between aldosterone and GPER in diabetes mellitus. Therefore, we hypothesized that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors on vascular reactivity are decreased in diabetes mellitus. Female control and diabetic (db/db) mice [leptin receptor knockout mice that develop obesity and type 2 diabetes] were used. We determined the expression of GPER and the effect of aldosterone in the presence of MR and GPER antagonists in arteries from control and db/db mice and the major signaling pathways involved. The diabetic group showed increased GPER expression, but not MR. In the presence of aldosterone the control increased the maximal contractile response to phenylephrine (PE), and this increase was reversed by the use of GPER antagonist, G15. The response to PE is already increased in the diabetic group. Although aldosterone did not cause further increase the use of MR and GPER antagonists reduced the maximum response to PE at the same level of control. Aldosterone also reduced the potency of acetylcholine (ACh)-induced relaxation in both groups by the activation of MR. GPER antagonism caused further decrease in the potency of ACh-induced relaxation in the control group, while not affecting the response of the diabetic group. These findings confirm the hypothesis that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors are decreased in diabetes mellitus. Our results contribute to understanding the mechanisms that aldosterone influences the vascular damage in diabetes through activation of MR and GPER receptors.

O diabetes é uma doença crônica que afeta mais de 8% da população mundial. As alterações vasculares estão relacionadas às principais complicações do diabetes. A aldosterona contribui para a disfunção endotelial após a ativação do receptor mineralocorticóide (MR). Recentemente, foi demonstrado que a aldosterona ativa o receptor de estrógeno acoplado à proteína G (GPER). A ativação de GPER está relacionada a efeitos benéficos na vasculatura. Entretanto, ainda não existem estudos em artérias de resistência relacionando aldosterona e GPER e essa interação no diabetes. Dessa forma, o presente estudo testou a hipótese de que a aldosterona ativando receptores GPER promove efeitos benéficos na vasculatura, mas esses efeitos estão diminuídos no diabetes. Os objetivos foram investigar os níveis de expressão de GPER nos animais controle e db/db [camundongos com mutação no receptor de leptina que desenvolvem obesidade e diabetes tipo 2], quais efeitos da aldosterona são mediados por ativação de GPER e quais mecanismos envolvidos nessa ativação e verificar se estão alterados no diabetes. O grupo diabético apresentou maior expressão de GPER, mas não de MR. A aldosterona promoveu aumento da resposta máxima contrátil à fenilefrina (PE) somente no grupo controle, que foi revertido pelo uso do antagonista de GPER, G15. No grupo diabético, a resposta à PE já é aumentada, o uso dos antagonistas de MR e GPER reduziram a resposta da PE. A aldosterona ainda reduziu a potência de relaxamento da acetilcolina (ACh) em ambos os grupos, por ativação de MR. O antagonismo de GPER por G15 promoveu um redução adicional na potência do relaxamento no grupo controle, mas não afetou a resposta do grupo diabético. Esses achados confirmam a hipótese de que GPER exerce um papel benéfico na vasculatura e esse efeito é perdido no diabetes. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos que a aldosterona influencia os danos vasculares no diabetes através da ativação de receptores MR e GPER. / Diabetes is a chronic disease that affects more than 8 % of the world population. Vascular changes are related to the major complications of diabetes. Aldosterone contributes to endothelial dysfunction after activation of the mineralocorticoid receptor (MR). It was recently shown that aldosterone also activates the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) and induces non genomic effects. The activation of GPER by estrogen or G1 is related to beneficial effects on the vasculature. However, there are no studies demonstrating the relationship between aldosterone and GPER in diabetes mellitus. Therefore, we hypothesized that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors on vascular reactivity are decreased in diabetes mellitus. Female control and diabetic (db/db) mice [leptin receptor knockout mice that develop obesity and type 2 diabetes] were used. We determined the expression of GPER and the effect of aldosterone in the presence of MR and GPER antagonists in arteries from control and db/db mice and the major signaling pathways involved. The diabetic group showed increased GPER expression, but not MR. In the presence of aldosterone the control increased the maximal contractile response to phenylephrine (PE), and this increase was reversed by the use of GPER antagonist, G15. The response to PE is already increased in the diabetic group. Although aldosterone did not cause further increase the use of MR and GPER antagonists reduced the maximum response to PE at the same level of control. Aldosterone also reduced the potency of acetylcholine (ACh)-induced relaxation in both groups by the activation of MR. GPER antagonism caused further decrease in the potency of ACh-induced relaxation in the control group, while not affecting the response of the diabetic group. These findings confirm the hypothesis that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors are decreased in diabetes mellitus. Our results contribute to understanding the mechanisms that aldosterone influences the vascular damage in diabetes through activation of MR and GPER receptors.

Alterações no sistema glutamatérgico e mudanças no funcionamento do córtex pré-frontal medial (CPFm) têm sido associadas a diversos distúrbios psiquiátricos, dentre os quais a ansiedade. Também é reconhecido que alterações nas concentrações circulantes de glicocorticóides podem induzir alterações nas sinapses e circuitos glutamatérgicos e, consequentemente, modificar a reatividade emocional dos animais. Embora se saiba que os glicocorticóides influenciam a liberação de glutamato no CPFm, a interação entre os efeitos mediados pelos receptores mineralocorticóides (MR) ou glicocorticóides (GR) e o sistema glutamatérgico, na expressão da resposta condicionada de medo, ainda não está elucidada. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo foram investigar (i) a influência dos glicocorticóides na expressão do medo condicionado contextual e seus efeitos sobre a atividade do CPFm em ratos, (ii) o papel dos receptores MR e GR localizados no córtex prelímbico (PrL) na expressão da resposta condicionada de congelamento e (iii) a interação entre os mecanismos mediados pelos glicocorticoides e o sistema glutamatérgico, via receptores do tipo NMDA, na expressão dessa resposta. Ratos Wistar machos foram tratados com veículo ou metirapona, um bloqueador de síntese de corticosterona, e expostos a um contexto previamente pareado com choque nas patas. Foram avaliados o tempo de medo contextual (comportamento de congelamento) e a expressão de proteína Fos em diferentes regiões do CPFm. Os resultados mostraram que a exposição ao contexto aversivo levou a um aumento significativo da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, nas áreas do córtex cingulado anterior 1 e 2 (Cg1 e Cg2), mas não no córtex infralímbico. A administração de metirapona levou a uma diminuição da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, Cg1 e Cg2. A administração bilateral de espironolactona, um antagonista de receptores MR, no PrL antes do teste diminuiu as respostas de medo e o pré-tratamento com RU38486, um antagonista de receptores GR, aboliu este efeito. Os resultados também mostraram que a diminuição da resposta de congelamento induzida por injeções intra-PrL de corticosterona foi abolida pela administração prévia de RU38486, mas não por espironolactona, indicando que a corticosterona recruta preferencialmente os receptores GR para produzir esses efeitos. A administração prévia do antagonista de receptor NMDA também preveniu os efeitos induzidos pelo tratamento com corticosterona sugerindo que, no PrL, parte dos efeitos rápidos do glicocorticóides sobre a expressão do medo condicionado se dá por uma interação com o sistema glutamatérgico. A administração de NMDA no PrL, antes do teste, induziu efeitos similares ao tratamento com corticosterona nessa região. De modo geral, os resultados sugerem que a liberação de corticosterona durante a apresentação de um estímulo condicionado aversivo influencia a atividade do CPFm de maneira que, uma mudança no equilíbrio das atividades mediadas por MR e GR, por meio de um aumento da atividade de GR, interage com o sistema glutamatérgico via aumento da atividade dos receptores NMDA influenciando a expressão da resposta de medo condicionado contextual. Sugere-se que a redução na expressão do medo condicionado observada após a administração local de corticosterona no PrL também seja decorrente de mudanças no equilíbrio entre MR e GR em direção a um aumento de suas ações mediadas por GR, assim como um aumento na liberação de glutamato e maior atividade de receptores NMDA nessa região. / Changes in the glutamatergic system and in the functioning of the medial prefrontal cortex (mPFC) have been associated with different psychiatric disorders, including anxiety. It is also recognized that changes in circulating levels of glucocorticoids can induce changes in glutamatergic synapses and circuits and therefore alter the emotional reactivity of animals. Although is known that glucocorticoids can influence the release of glutamate in the mPFC, the interaction between mineralocorticoid receptors (MR) and glucocorticoid receptors (GR) activation and the glutamatergic activity on the expression of conditioned fear response is not yet elucidated. The aims of the present study were to investigate (i) the influence of glucocorticoids on the expression of contextual conditioned fear and its effects in the activity of the mPFC in rats, (ii) the role of MR and GR in the prelimbic cortex (PrL) on expression of conditioned freezing response and (iii) a possible interaction between the effects mediated by the glucocorticoids and the glutamatergic system, via NMDA receptors on the expression of this response. Male Wistar rats were treated with vehicle or metyrapone, a corticosterone synthesis blocker, and exposed to a context previously paired with footshock. The time of contextual fear (freezing behavior) and Fos protein expression in different regions of mPFC were evaluated. The results showed that exposure to the aversive context induced a significant increase in freezing and Fos protein expression in the PrL, in the anterior cingulate cortex, areas 1 and 2 (Cg1 and Cg2), but not in the infralimbic cortex. The administration of metyrapone induced a decrease on the expression of freezing and Fos in PrL, Cg1 and Cg2. Bilateral administration of spironolactone (a MR antagonist) in PrL before the test, decreased conditioned fear response and the pretreatment with RU38486 (a GR antagonist) abolished this effect. The results also showed that the decrease of freezing response induced by intra-PrL corticosterone injections was abolished by prior administration of RU38486, but not by spironolactone, indicating that corticosterone recruits preferentially GR to produce the observed effects. Prior administration of the NMDA receptor antagonist also prevented the effects induced by corticosterone treatment in the PrL, suggesting that part of rapid effects of glucocorticoids on the expression of conditioned fear occurs by an interaction with the glutamatergic system. Additionally, NMDA administration in the PrL prior to the test induced similar effects to corticosterone treatment in this region. Overall, the results suggest that the release of corticosterone during the presentation of a conditioned aversive stimulus influences the mPFC activity so that a change in the balance of the activities mediated by MR and GR through an increase in GR activity interacts with the glutamatergic system by increasing the activity of NMDA receptors influencing the expression of contextual fear conditioning response. It is suggested that the reduction in the expression of conditioned fear observed after local administration of corticosterone in the PrL is also due to changes in the balance between MR and GR towards an increase in the actions mediated by GR, as well as an increase in the release of glutamate and a greater NMDA receptor activity in this region.

Alterações no sistema glutamatérgico e mudanças no funcionamento do córtex pré-frontal medial (CPFm) têm sido associadas a diversos distúrbios psiquiátricos, dentre os quais a ansiedade. Também é reconhecido que alterações nas concentrações circulantes de glicocorticóides podem induzir alterações nas sinapses e circuitos glutamatérgicos e, consequentemente, modificar a reatividade emocional dos animais. Embora se saiba que os glicocorticóides influenciam a liberação de glutamato no CPFm, a interação entre os efeitos mediados pelos receptores mineralocorticóides (MR) ou glicocorticóides (GR) e o sistema glutamatérgico, na expressão da resposta condicionada de medo, ainda não está elucidada. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo foram investigar (i) a influência dos glicocorticóides na expressão do medo condicionado contextual e seus efeitos sobre a atividade do CPFm em ratos, (ii) o papel dos receptores MR e GR localizados no córtex prelímbico (PrL) na expressão da resposta condicionada de congelamento e (iii) a interação entre os mecanismos mediados pelos glicocorticoides e o sistema glutamatérgico, via receptores do tipo NMDA, na expressão dessa resposta. Ratos Wistar machos foram tratados com veículo ou metirapona, um bloqueador de síntese de corticosterona, e expostos a um contexto previamente pareado com choque nas patas. Foram avaliados o tempo de medo contextual (comportamento de congelamento) e a expressão de proteína Fos em diferentes regiões do CPFm. Os resultados mostraram que a exposição ao contexto aversivo levou a um aumento significativo da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, nas áreas do córtex cingulado anterior 1 e 2 (Cg1 e Cg2), mas não no córtex infralímbico. A administração de metirapona levou a uma diminuição da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, Cg1 e Cg2. A administração bilateral de espironolactona, um antagonista de receptores MR, no PrL antes do teste diminuiu as respostas de medo e o pré-tratamento com RU38486, um antagonista de receptores GR, aboliu este efeito. Os resultados também mostraram que a diminuição da resposta de congelamento induzida por injeções intra-PrL de corticosterona foi abolida pela administração prévia de RU38486, mas não por espironolactona, indicando que a corticosterona recruta preferencialmente os receptores GR para produzir esses efeitos. A administração prévia do antagonista de receptor NMDA também preveniu os efeitos induzidos pelo tratamento com corticosterona sugerindo que, no PrL, parte dos efeitos rápidos do glicocorticóides sobre a expressão do medo condicionado se dá por uma interação com o sistema glutamatérgico. A administração de NMDA no PrL, antes do teste, induziu efeitos similares ao tratamento com corticosterona nessa região. De modo geral, os resultados sugerem que a liberação de corticosterona durante a apresentação de um estímulo condicionado aversivo influencia a atividade do CPFm de maneira que, uma mudança no equilíbrio das atividades mediadas por MR e GR, por meio de um aumento da atividade de GR, interage com o sistema glutamatérgico via aumento da atividade dos receptores NMDA influenciando a expressão da resposta de medo condicionado contextual. Sugere-se que a redução na expressão do medo condicionado observada após a administração local de corticosterona no PrL também seja decorrente de mudanças no equilíbrio entre MR e GR em direção a um aumento de suas ações mediadas por GR, assim como um aumento na liberação de glutamato e maior atividade de receptores NMDA nessa região. / Changes in the glutamatergic system and in the functioning of the medial prefrontal cortex (mPFC) have been associated with different psychiatric disorders, including anxiety. It is also recognized that changes in circulating levels of glucocorticoids can induce changes in glutamatergic synapses and circuits and therefore alter the emotional reactivity of animals. Although is known that glucocorticoids can influence the release of glutamate in the mPFC, the interaction between mineralocorticoid receptors (MR) and glucocorticoid receptors (GR) activation and the glutamatergic activity on the expression of conditioned fear response is not yet elucidated. The aims of the present study were to investigate (i) the influence of glucocorticoids on the expression of contextual conditioned fear and its effects in the activity of the mPFC in rats, (ii) the role of MR and GR in the prelimbic cortex (PrL) on expression of conditioned freezing response and (iii) a possible interaction between the effects mediated by the glucocorticoids and the glutamatergic system, via NMDA receptors on the expression of this response. Male Wistar rats were treated with vehicle or metyrapone, a corticosterone synthesis blocker, and exposed to a context previously paired with footshock. The time of contextual fear (freezing behavior) and Fos protein expression in different regions of mPFC were evaluated. The results showed that exposure to the aversive context induced a significant increase in freezing and Fos protein expression in the PrL, in the anterior cingulate cortex, areas 1 and 2 (Cg1 and Cg2), but not in the infralimbic cortex. The administration of metyrapone induced a decrease on the expression of freezing and Fos in PrL, Cg1 and Cg2. Bilateral administration of spironolactone (a MR antagonist) in PrL before the test, decreased conditioned fear response and the pretreatment with RU38486 (a GR antagonist) abolished this effect. The results also showed that the decrease of freezing response induced by intra-PrL corticosterone injections was abolished by prior administration of RU38486, but not by spironolactone, indicating that corticosterone recruits preferentially GR to produce the observed effects. Prior administration of the NMDA receptor antagonist also prevented the effects induced by corticosterone treatment in the PrL, suggesting that part of rapid effects of glucocorticoids on the expression of conditioned fear occurs by an interaction with the glutamatergic system. Additionally, NMDA administration in the PrL prior to the test induced similar effects to corticosterone treatment in this region. Overall, the results suggest that the release of corticosterone during the presentation of a conditioned aversive stimulus influences the mPFC activity so that a change in the balance of the activities mediated by MR and GR through an increase in GR activity interacts with the glutamatergic system by increasing the activity of NMDA receptors influencing the expression of contextual fear conditioning response. It is suggested that the reduction in the expression of conditioned fear observed after local administration of corticosterone in the PrL is also due to changes in the balance between MR and GR towards an increase in the actions mediated by GR, as well as an increase in the release of glutamate and a greater NMDA receptor activity in this region.