O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e também o primeiro do mundo na produção de açúcar e etanol, o biocombustível mais utilizado como alternativa energética no país (BRASIL, 2017). No entanto, esse processo produtivo precisa considerar os subprodutos gerados, principalmente a vinhaça, que se não tratada e disposta corretamente podem causar problemas ambientais sérios. Sendo um efluente com alta carga orgânica, a vinhaça concentra potencial substancial para geração de bioenergia como o metano. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da concentração de sulfato, advindo da utilização de ácido sulfúrico para manutenção da pureza das cepas fermentativas e incorporado à vinhaça, na produção de metano. Para tanto, testes em batelada foram feitos com relações DQO/Sulfato diferentes. As respostas obtidas no planejamento experimental fatorial 22 com ponto central, utilizando a demanda química de oxigênio (DQO) e sulfato como os fatores, foram a produção de metano, a eficiência de remoção de matéria orgânica e a eficiência de remoção de sulfato ao longo dos ciclos de operação. As faixas estudadas foram de 4,6 a 2,0 gDQO.L-1 e 0,3 a 2,3 gSO4-2.L-1. Dessa forma, para o intervalo de concentrações testadas, a quantidade de matéria orgânica foi o fator mais importante para a produção de metano, e foi constatado que o sulfato possuiu efeito negativo em sua produção. Para a eficiência de remoção de matéria orgânica, a interação dos fatores foi a mais significativa, mostrando que a participação das bactérias redutoras de sulfato foi positiva, aumentando a eficiência de remoção. Com relação à eficiência de remoção do sulfato, apenas a concentração de sulfato foi significativa para a remoção do mesmo, quanto maior a concentração menor foi a eficiência de remoção observada. A maior produção de metano ocorreu na condição 4,6 gDQO.L-1 e 0,3 gSO4-2.L-1, DQO/SO42- de 12,5, em que a eficiência de remoção de matéria orgânica foi de 80% e a de sulfato foi de 89%. A biomassa desenvolveu as rotas metanogênica e sulfetogênica, sendo a metanogênica responsável pela maior eficiência de remoção (85% do total). Sequenciamento Illumina MiSeq 16S rRNA foi feito no inóculo utilizado nos experimentos, indicando a presença abundante das bactérias capazes de produzir acetato (54,75%), dentre elas o gênero Desulfofaba (Bactéria Redutora de Sulfato Oxidativa Incompleta, 7,08%), mostrando uma predisposição da rota metanogênica pela via do acetato ser a predominante. / Brazil is the world\'s largest producer of sugarcane and the world\'s leading producer of sugar and ethanol, the most used biofuel as an energy alternative in the country (BRASIL, 2017). However, this productive process needs to consider the by-products generated, especially the vinasse, which if not treated and disposed properly can cause serious environmental problems. Being an effluent with high organic load, vinasse concentrates potential for bioenergy generation as methane. The objective of this work was to evaluate the influence of the sulfate concentration, resulting from the use of sulfuric acid to maintain purity of fermentative strains and incorporated into vinasse, in the production of methane. For that, batch tests were done with different COD/SO42- ratios. The responses obtained in the 22 design of experiment with central point, using the chemical oxygen demand (COD) and sulfate, as the factors were the methane production, the organic matter removal efficiency and the sulfate removal efficiency along the cycles of operation. The ranges studied were 4.6 to 2.0 gDQO.L-1 and 0.3 to 2.3 gSO42-.L-1. Therefore, for the range of concentrations tested, the amount of organic matter was the most important factor for the production of methane, and it was verified that the sulfate had a negative effect on its production. For the removal efficiency of organic matter, the interaction of the factors was the most significant, showing that the participation of the sulfate reducing bacteria was positive, increasing the removal efficiency. Regarding the sulfate removal efficiency, only the sulfate concentration was significant for the removal of itself, the higher the concentration the lower the observed removal efficiency. The highest methane production occurred in the condition 4.6 gDQO.L-1 and 0.3 gSO4-2.L-1, COD/SO42- of 12.5, where the removal efficiency of organic matter was 80% and sulfate was 89%. The biomass developed the methanogenic and sulfetogenic routes, being the methanogenic responsible for the greater removal efficiency (85% of the total). Sequencing Illumina MiSeq 16S rRNA was done in the inoculum used in the experiments, indicating the abundant presence of bacteria capable of producing acetate (54.75%), among them the genus Desulfofaba (Incomplete Oxidative Sulfate Reducing Bacteria, 7.08%), showing a predisposition of the methanogenic route through the acetate route is the predominant one.