A tubulização tem sido considerada uma alternativa eficaz no reparo de lesões de nervos por permitir a aplicação local de fatores neurotróficos e facilitar estudos experimentais. A compreensão do mecanismo de ação no processo regenerativo é intrinsecamente dependente da identificação dos componentes moleculares ao longo dos processos degenerativo e regenerativo. A presente tese visa o estudo sequencial da identificação do perfil molecular da resposta imune no processo de regeneração de nervo entre duas técnicas microcirúrgicas: a tubulização látero-terminal (TLT) e a tubulização término-terminal (TTT). Ratas Wistar adultas foram submetidas à transecção bilateral do nervo fibular comum. Na técnica TLT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, o coto proximal foi suturado na musculatura e um tubo de silicone vazio (6mm) foi interposto entre a lateral do nervo tibial (doador) e o coto distal do fibular. Na técnica TTT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, e ambos os cotos foram suturados às extremidades do tubo de silicone vazio. Foram realizados os grupos experimentais: TLT convencional (TLT padrão), TLT com tubo fechado suturado a porção proximal (TLT F-P), TLT com tubo fechado suturado na porção distal (TLT FD), TTT convencional (TTT padrão), TTT com tubo fechado suturado ao coto proximal (TTT F-P), TTT com tubo fechado suturado ao coto distal (TTT F-D). O controle normal (grupo GN) foi o segmento de nervo retirado para a interposição do tubo. As análises foram realizadas em três tempos pós-cirurgia: 24 horas, 96 horas e 8 dias. As amostras foram processadas em teste comercial para identificação de anticorpos com intuito de determinar a intensidade de expressão de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento presentes no cone de crescimento dos diferentes grupos. Em 24h a expressão de citocinas foi similar entre os grupos, entretanto, o TLT apresentou maior número de quimiocinas expressas em relação ao TTT. O tempo de 96h foi o período com maior número de elementos que apresentaram aumento da expressão em ambos os grupos TLT e TTT, sendo o grupo TLT a apresentar número maior de quimiocinas e fatores de crescimento expressos. Em 8 dias, houve redução dos níveis de expressão de todos os elementos estudados em ambos os grupos, com exceção do CNTF que apresentou aumento de sua expressão no grupo TTT. Os grupos fechados proximais (TLT F-P e TTT F-P) apresentaram perfis de expressão distintos no tempo de 24h, não houve mudanças dos níveis de expressão de nenhum dos elementos do grupo TLT, sendo que, inversamente, o grupo TTT apresentou aumento da expressão de grande parte das proteínas estudadas. Em ambos os grupos TLT F-P e TTT F-P, os elementos investigados retornaram aos níveis basais de expressão em 96h e 8 dias. Os grupos fechados distais (TLT F-D e TTT F-D) apresentaram expressão mínima ou nenhuma dos elementos estudados. O presente estudo demonstrou que há diferenças quanto ao perfil molecular da resposta imune induzida por lesão de nervo entre as técnicas TLT e TTT. / Nerve tubulization has been considered an effective alternative to repair nerve damages due to allow the local application of growth factors and to facilitate experimental studies. The action mechanisms comprehension in nerve regeneration is intrinsically dependente of the molecular components identification over the degenerative and regenerative processes. The aim of this study was the sequencial analysis of the molecular identification of the imune response in nerve regeneration process between two microsurgical repair techniques: the end-to-side tubulization (EST) and the end-to-end tubulization (ETE). Bilateral transection of the common fibular nerve was done in adults female Wistar rats. EST model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, the proximal stump was sutured in the musculature and an empty silicone tube (6mm) was interposed between the lateral portion of the intact tibial donor nerve and the fibular nerve distal stump. ETE model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, both stumps were sutured to the silicone tube extremities. The experimentals groups done: EST conventional (EST standard), EST with closed tube sutured on the proximal portion (EST C-P), EST with closed tube sutured on the distal portion (EST C-D), ETE conventional (ETE standard), ETE with closed tube sutured on the proximal stump (ETE C-P), ETE with closed tube sutured on the distal stump (ETE C-D). The normal control (NG group) was the nerve extension removed to the tube interposition. The analyzes were performed in three times: 24 hours, 96 hours and 8 days. The samples were precessed on an antibody arrays to determine the expression intensity of cytokines, chemokines ans growth factors in the growth cone of the diferente groups. On 24h the cytokine expression was similar between groups, however, the ETE group presented a higher number of the expressed chemokines than ETS. The time 96h was the period with higher number of elements that presented increased expression in both groups EST and ETE, being the group ETS to presents higher number of the chemokines and growth factors expressed. In 8 days there was expression levels reduced of the all studied elements in both groups, with the exception of CNTF that presented increased expression on ETE group. The proximals closed groups (ETS C-P and ETE CP) presented different expression profiles on the time of 24h, there were no changes in the expression levels of any of the elements of the ETS group, whereas, conversely, the ETE group showed increased expression of a large part of the proteins studied. In both groups ETS C-P and ETE C-P, the investigated elements returned to baseline levels of expression at the 96h and 8 days dates. The distal closed groups (ETS C-D and ETE CD) presented minimal expression or no expression of the studied elements. This study demonstrates that there are differences referring to the molecular profile of the immune response induced by nerve damage between the ETS and ETE models.

A tubulização tem sido considerada uma alternativa eficaz no reparo de lesões de nervos por permitir a aplicação local de fatores neurotróficos e facilitar estudos experimentais. A compreensão do mecanismo de ação no processo regenerativo é intrinsecamente dependente da identificação dos componentes moleculares ao longo dos processos degenerativo e regenerativo. A presente tese visa o estudo sequencial da identificação do perfil molecular da resposta imune no processo de regeneração de nervo entre duas técnicas microcirúrgicas: a tubulização látero-terminal (TLT) e a tubulização término-terminal (TTT). Ratas Wistar adultas foram submetidas à transecção bilateral do nervo fibular comum. Na técnica TLT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, o coto proximal foi suturado na musculatura e um tubo de silicone vazio (6mm) foi interposto entre a lateral do nervo tibial (doador) e o coto distal do fibular. Na técnica TTT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, e ambos os cotos foram suturados às extremidades do tubo de silicone vazio. Foram realizados os grupos experimentais: TLT convencional (TLT padrão), TLT com tubo fechado suturado a porção proximal (TLT F-P), TLT com tubo fechado suturado na porção distal (TLT FD), TTT convencional (TTT padrão), TTT com tubo fechado suturado ao coto proximal (TTT F-P), TTT com tubo fechado suturado ao coto distal (TTT F-D). O controle normal (grupo GN) foi o segmento de nervo retirado para a interposição do tubo. As análises foram realizadas em três tempos pós-cirurgia: 24 horas, 96 horas e 8 dias. As amostras foram processadas em teste comercial para identificação de anticorpos com intuito de determinar a intensidade de expressão de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento presentes no cone de crescimento dos diferentes grupos. Em 24h a expressão de citocinas foi similar entre os grupos, entretanto, o TLT apresentou maior número de quimiocinas expressas em relação ao TTT. O tempo de 96h foi o período com maior número de elementos que apresentaram aumento da expressão em ambos os grupos TLT e TTT, sendo o grupo TLT a apresentar número maior de quimiocinas e fatores de crescimento expressos. Em 8 dias, houve redução dos níveis de expressão de todos os elementos estudados em ambos os grupos, com exceção do CNTF que apresentou aumento de sua expressão no grupo TTT. Os grupos fechados proximais (TLT F-P e TTT F-P) apresentaram perfis de expressão distintos no tempo de 24h, não houve mudanças dos níveis de expressão de nenhum dos elementos do grupo TLT, sendo que, inversamente, o grupo TTT apresentou aumento da expressão de grande parte das proteínas estudadas. Em ambos os grupos TLT F-P e TTT F-P, os elementos investigados retornaram aos níveis basais de expressão em 96h e 8 dias. Os grupos fechados distais (TLT F-D e TTT F-D) apresentaram expressão mínima ou nenhuma dos elementos estudados. O presente estudo demonstrou que há diferenças quanto ao perfil molecular da resposta imune induzida por lesão de nervo entre as técnicas TLT e TTT. / Nerve tubulization has been considered an effective alternative to repair nerve damages due to allow the local application of growth factors and to facilitate experimental studies. The action mechanisms comprehension in nerve regeneration is intrinsically dependente of the molecular components identification over the degenerative and regenerative processes. The aim of this study was the sequencial analysis of the molecular identification of the imune response in nerve regeneration process between two microsurgical repair techniques: the end-to-side tubulization (EST) and the end-to-end tubulization (ETE). Bilateral transection of the common fibular nerve was done in adults female Wistar rats. EST model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, the proximal stump was sutured in the musculature and an empty silicone tube (6mm) was interposed between the lateral portion of the intact tibial donor nerve and the fibular nerve distal stump. ETE model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, both stumps were sutured to the silicone tube extremities. The experimentals groups done: EST conventional (EST standard), EST with closed tube sutured on the proximal portion (EST C-P), EST with closed tube sutured on the distal portion (EST C-D), ETE conventional (ETE standard), ETE with closed tube sutured on the proximal stump (ETE C-P), ETE with closed tube sutured on the distal stump (ETE C-D). The normal control (NG group) was the nerve extension removed to the tube interposition. The analyzes were performed in three times: 24 hours, 96 hours and 8 days. The samples were precessed on an antibody arrays to determine the expression intensity of cytokines, chemokines ans growth factors in the growth cone of the diferente groups. On 24h the cytokine expression was similar between groups, however, the ETE group presented a higher number of the expressed chemokines than ETS. The time 96h was the period with higher number of elements that presented increased expression in both groups EST and ETE, being the group ETS to presents higher number of the chemokines and growth factors expressed. In 8 days there was expression levels reduced of the all studied elements in both groups, with the exception of CNTF that presented increased expression on ETE group. The proximals closed groups (ETS C-P and ETE CP) presented different expression profiles on the time of 24h, there were no changes in the expression levels of any of the elements of the ETS group, whereas, conversely, the ETE group showed increased expression of a large part of the proteins studied. In both groups ETS C-P and ETE C-P, the investigated elements returned to baseline levels of expression at the 96h and 8 days dates. The distal closed groups (ETS C-D and ETE CD) presented minimal expression or no expression of the studied elements. This study demonstrates that there are differences referring to the molecular profile of the immune response induced by nerve damage between the ETS and ETE models.

Foi realizado um estudo experimental da influência do ultra-som terapêutico na regeneração do nervo ciático submetido a esmagamento controlado, em ratos. Foram empregados no estudo 20 ratos da linhagem Wistar, de peso médio em torno de 250 g, divididos em dois grupos, conforme o tipo de procedimento realizado: 1) somente esmagamento, dez ratos; e 2) esmagamento e irradiação com ultra-som, 10 ratos. Sob anestesia, o nervo ciático era exposto na coxa direita do animal e esmagado com um dispositivo especialmente idealizado e confeccionado para essa finalidade, com uma carga fixa de 15 Kg, por 10 minutos, num segmento de 5 mm proximal à sua bifurcação. A irradiação com o ultra-som pulsado (1:5, freqüência de 1 MHz, intensidade de 0.4 W/'CM POT.2', duração de 2 minutos) era iniciada já no primeiro dia pós-operatório e realizada por dez dias consecutivos. Os resultados foram avaliados pela análise funcional da impressão plantar dos animais obtidas numa pista de marcha e determinação do índice funcional do ciático (De Medinaceli e Bain, Mackinnon e Hunter), e pela morfometria, através do cálculo da densidade de fibras nervosas, após sacrifício dos animais no vigésimo primeiro dia pós-operatório. Os resultados foram submetidos a análise estatística e mostraram que, nas condições do trabalho, o ultra-som acelerou a regeneração do nervo, demonstrável com significância no vigésimo primeiro dia pós-operatório / An experimental study of the influence of therapeutic ultrasound on the regeneration of the sciatic nerve submitted to controlled crush injury was carried out in rats. Twenty female Wistar rats weighing 250 g on average were used and distributed in two groups according to the procedure: 1) crush injury only, ten rats; 2) crush injury followed by ultrasound irradiation, ten rats. Under general anesthesia the sciatic nerve was exposed on the right thigh and crushed with a device especially devised and built for that purpose, with a 15 kg constant load for 10 minutes, affecting a 5 mm-long segment of the nerve proximal to its bifurcation. Pulsed ultrasound irradiation (1:5, 1 MHz frequency, 0.4 W/'CM POT.2' intensity, 2 minutes duration) was started the day after the operation and repeated for ten consecutive days. The results were evaluated by functional footprint analysis and determination of the sciatic functional index (DeMedinaceli's and Bain, Mackinnon and Hunter's methods) at weekly intervals, and by morphometry (nerve fiber density) of the resected sciatic nerve after killing the animals on the 21st postoperative day. Results were submitted to statistical evaluation and showed that, in the conditions of the study, ultrasound accelerated nerve regeneration, as demonstrated with significance on the 21st postoperative day

Foi avaliada a reprodutibilidade entre examinadores do método de avaliação do Índice Funcional do Ciático (IFC), medido por um programa de computação desenvolvido para este fim. Foram empregados 20 ratos Wistar, cujo nervo ciático direito era abordado sob anestesia geral e esmagado num segmento de 5 mm proximal à sua trifurcação com um dispositivo especial, com carga fixa de 5 kgf por 10 minutos. Impressões das pegadas dos animais foram obtidas na fase pré-operatória e, depois, semanalmente, da 1ª à 8ª semana pós-operatória, em uma pista de marcha. As impressões eram digitalizadas, armazenadas e avaliadas, pela medida de parâmetros pré-determinados, por quatro examinadores, seguindo sempre a mesma seqüência de marcação dos parâmetros. Os resultados foram submetidos à análise estatística, que mostrou haver um alto índice de correlação entre examinadores na avaliação pré-operatória e nas 3a, 4a, 5a, 7a e 8a semanas (igual ou maior que 0,82), com queda casual na 6a semana, mas manteve significante como as demais (pF?0,01). Na 1a e 2a semanas, o índice de correlação foi próximo de zero, mostrando a pouca reprodutibilidade do método nesse período, em que a variabilidade entre os animais não diferiu da variabilidade entre os examinadores (pF?0,24 e 0,32, respectivamente), devido à pouca definição das impressões das pegadas. / The Sciatic Functional Index (SFI) is a quite useful tool to evaluate functional recovery of the sciatic nerve of rats in a number of experimental lesions and treatment. Although being an objective method, it depends on the examiner?s ability to adequately recognize and mark the previously established footprint landmarks, which is an entirely subjective step, thus potentially interfering with the calculations according to the mathematical formulae proposed by different authors. An inter-personal evaluation of the reproducibility of an SFI computer aided method was then carried out here to study data variability. A severe crush injury was produce on a 5 mm-long segment of the right sciatic nerve of 20 Wistar rats (5kgf load directly applied for 10 minutes) and the SFI was measured by four different examiners (2 experienced and 2 new-comers) either preoperatively and at weekly intervals from the 1st to the 8th postoperative week. Three measurements were made for each print and an average was drawn and used for the statistical analysis. The results showed that interexaminer correlation was high (0.82) on the 3rd, 4th, 5th, 7th and 8th weeks, with an unexpected (pF?0.01) drop on the 6th week. There was virtually no inter-personal correlation (correlation index nearly 0) on the 1st and 2nd weeks, period in which the variability between animals (pF?0.24) and examiners (pF?0.32) was similar, certainly due to the poor definition of the footprints. The authors conclude that the SFI method studied here is only reliable from the 3rd week on.

Foi avaliada a reprodutibilidade entre examinadores do método de avaliação do Índice Funcional do Ciático (IFC), medido por um programa de computação desenvolvido para este fim. Foram empregados 20 ratos Wistar, cujo nervo ciático direito era abordado sob anestesia geral e esmagado num segmento de 5 mm proximal à sua trifurcação com um dispositivo especial, com carga fixa de 5 kgf por 10 minutos. Impressões das pegadas dos animais foram obtidas na fase pré-operatória e, depois, semanalmente, da 1ª à 8ª semana pós-operatória, em uma pista de marcha. As impressões eram digitalizadas, armazenadas e avaliadas, pela medida de parâmetros pré-determinados, por quatro examinadores, seguindo sempre a mesma seqüência de marcação dos parâmetros. Os resultados foram submetidos à análise estatística, que mostrou haver um alto índice de correlação entre examinadores na avaliação pré-operatória e nas 3a, 4a, 5a, 7a e 8a semanas (igual ou maior que 0,82), com queda casual na 6a semana, mas manteve significante como as demais (pF?0,01). Na 1a e 2a semanas, o índice de correlação foi próximo de zero, mostrando a pouca reprodutibilidade do método nesse período, em que a variabilidade entre os animais não diferiu da variabilidade entre os examinadores (pF?0,24 e 0,32, respectivamente), devido à pouca definição das impressões das pegadas. / The Sciatic Functional Index (SFI) is a quite useful tool to evaluate functional recovery of the sciatic nerve of rats in a number of experimental lesions and treatment. Although being an objective method, it depends on the examiner?s ability to adequately recognize and mark the previously established footprint landmarks, which is an entirely subjective step, thus potentially interfering with the calculations according to the mathematical formulae proposed by different authors. An inter-personal evaluation of the reproducibility of an SFI computer aided method was then carried out here to study data variability. A severe crush injury was produce on a 5 mm-long segment of the right sciatic nerve of 20 Wistar rats (5kgf load directly applied for 10 minutes) and the SFI was measured by four different examiners (2 experienced and 2 new-comers) either preoperatively and at weekly intervals from the 1st to the 8th postoperative week. Three measurements were made for each print and an average was drawn and used for the statistical analysis. The results showed that interexaminer correlation was high (0.82) on the 3rd, 4th, 5th, 7th and 8th weeks, with an unexpected (pF?0.01) drop on the 6th week. There was virtually no inter-personal correlation (correlation index nearly 0) on the 1st and 2nd weeks, period in which the variability between animals (pF?0.24) and examiners (pF?0.32) was similar, certainly due to the poor definition of the footprints. The authors conclude that the SFI method studied here is only reliable from the 3rd week on.

Foi realizado um estudo experimental da influência do ultra-som terapêutico na regeneração do nervo ciático submetido a esmagamento controlado, em ratos. Foram empregados no estudo 20 ratos da linhagem Wistar, de peso médio em torno de 250 g, divididos em dois grupos, conforme o tipo de procedimento realizado: 1) somente esmagamento, dez ratos; e 2) esmagamento e irradiação com ultra-som, 10 ratos. Sob anestesia, o nervo ciático era exposto na coxa direita do animal e esmagado com um dispositivo especialmente idealizado e confeccionado para essa finalidade, com uma carga fixa de 15 Kg, por 10 minutos, num segmento de 5 mm proximal à sua bifurcação. A irradiação com o ultra-som pulsado (1:5, freqüência de 1 MHz, intensidade de 0.4 W/'CM POT.2', duração de 2 minutos) era iniciada já no primeiro dia pós-operatório e realizada por dez dias consecutivos. Os resultados foram avaliados pela análise funcional da impressão plantar dos animais obtidas numa pista de marcha e determinação do índice funcional do ciático (De Medinaceli e Bain, Mackinnon e Hunter), e pela morfometria, através do cálculo da densidade de fibras nervosas, após sacrifício dos animais no vigésimo primeiro dia pós-operatório. Os resultados foram submetidos a análise estatística e mostraram que, nas condições do trabalho, o ultra-som acelerou a regeneração do nervo, demonstrável com significância no vigésimo primeiro dia pós-operatório / An experimental study of the influence of therapeutic ultrasound on the regeneration of the sciatic nerve submitted to controlled crush injury was carried out in rats. Twenty female Wistar rats weighing 250 g on average were used and distributed in two groups according to the procedure: 1) crush injury only, ten rats; 2) crush injury followed by ultrasound irradiation, ten rats. Under general anesthesia the sciatic nerve was exposed on the right thigh and crushed with a device especially devised and built for that purpose, with a 15 kg constant load for 10 minutes, affecting a 5 mm-long segment of the nerve proximal to its bifurcation. Pulsed ultrasound irradiation (1:5, 1 MHz frequency, 0.4 W/'CM POT.2' intensity, 2 minutes duration) was started the day after the operation and repeated for ten consecutive days. The results were evaluated by functional footprint analysis and determination of the sciatic functional index (DeMedinaceli's and Bain, Mackinnon and Hunter's methods) at weekly intervals, and by morphometry (nerve fiber density) of the resected sciatic nerve after killing the animals on the 21st postoperative day. Results were submitted to statistical evaluation and showed that, in the conditions of the study, ultrasound accelerated nerve regeneration, as demonstrated with significance on the 21st postoperative day