Zugl.: Diss.

Essen, University, Diss., 2005--Duisburg.

Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 2008 / Hergestellt on demand. - Im Internet unter der Adresse http://uvka.ubka.uni-karlsruhe.de/shop/isbn/978-3-86644-246-7 verfügbar

Thema dieser Thesis ist die Analyse sekretorischer Vesikelpools auf Ultrastrukturebene in unterschiedlichen biologischen Systemen. Der erste und zweite Teil dieser Arbeit fokussiert sich auf die Analyse synaptischer Vesikelpools in neuromuskulären Endplatten (NME) im Modellorganismus Caenorhabditis elegans. Dazu wurde Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution angewandt, um eine unverzügliche Immobilisation der Nematoden und somit eine Fixierung im nahezu nativen Zustand zu gewährleisten. Anschließend wurden dreidimensionale Aufnahmen der NME mittels Elektronentomographie erstellt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden junge adulte, wildtypische C. elegans Hermaphroditen mit Septin-Mutanten verglichen. Um eine umfassende Analyse mit hoher Stichprobenzahl zu ermöglichen und eine automatisierte Lösung für ähnliche Untersuchungen von Vesikelpools bereit zu stellen wurde eine Software namens 3D ART VeSElecT zur automatisierten Vesikelpoolanalyse entwickelt. Die Software besteht aus zwei Makros für ImageJ, eines für die Registrierung der Vesikel und eines zur Charakterisierung. Diese Trennung in zwei separate Schritte ermöglicht einen manuellen Verbesserungsschritt zum Entfernen falsch positiver Vesikel. Durch einen Vergleich mit manuell ausgewerteten Daten neuromuskulärer Endplatten von larvalen Stadien des Modellorganismus Zebrafisch (Danio rerio) konnte erfolgreich die Funktionalität der Software bewiesen werden. Die Analyse der neuromuskulären Endplatten in C. elegans ergab kleinere synaptische Vesikel und dichtere Vesikelpools in den Septin-Mutanten verglichen mit Wildtypen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neuromuskulärer Endplatten junger adulter C. elegans Hermaphroditen mit Dauerlarven verglichen. Das Dauerlarvenstadium ist ein spezielles Stadium, welches durch widrige Umweltbedingungen induziert wird und in dem C. elegans über mehrere Monate ohne Nahrungsaufnahme überleben kann. Da hier der Vergleich der Abundanz zweier Vesikelarten, der „clear-core“-Vesikel (CCV) und der „dense-core“-Vesikel (DCV), im Fokus stand wurde eine Erweiterung von 3D ART VeSElecT entwickelt, die einen „Machine-Learning“-Algorithmus zur automatisierten Klassifikation der Vesikel integriert. Durch die Analyse konnten kleinere Vesikel, eine erhöhte Anzahl von „dense-core“-Vesikeln, sowie eine veränderte Lokalisation der DCV in Dauerlarven festgestellt werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde untersucht ob die für synaptische Vesikelpools konzipierte Software auch zur Analyse sekretorischer Vesikel in Thrombozyten geeignet ist. Dazu wurden zweidimensionale und dreidimensionale Aufnahmen am Transmissionselektronenmikroskop erstellt und verglichen. Die Untersuchung ergab, dass hierfür eine neue Methodik entwickelt werden muss, die zwar auf den vorherigen Arbeiten prinzipiell aufbauen kann, aber den besonderen Herausforderungen der Bilderkennung sekretorischer Vesikel aus Thrombozyten gerecht werden muss. / Subject of this thesis was the analysis of the ultrastructure of vesicle pools in various biological systems. The first and second part of this thesis is focused on the analysis of synaptic vesicle pools in neuromuscular junctions in the model organism Caenorhabditis elegans. In order to get access of synaptic vesicle pools in their near-to native state high-pressure freezing and freeze substitution was performed. Subsequently three-dimensional imaging of neuromuscular junctions using electron tomography was performed. In the first part young adult wild-type C. elegans hermaphrodites and septin mutants were compared. To enable extensive analysis and to provide an automated solution for comparable studies, a software called 3D ART VeSElecT for automated vesicle pool analysis, was developed. The software is designed as two macros for ImageJ, one for registration of vesicles and one for characterization. This separation allows for a manual revision step in between to erase false positive particles. Through comparison with manually evaluated data of neuromuscular junctions of larval stages of the model organism zebrafish (Danio rerio), functionality of the software was successfully proved. As a result, analysis of C. elegans neuromuscular junctions revealed smaller synaptic vesicles and more densely packed vesicle pools in septin mutants compared to wild-types. In the second part of this thesis NMJs of young adult C. elegans hermaphrodites were compared with dauer larvae. The dauer larva is a special state that is induced by adverse environmental conditions and enables C. elegans to survive several months without any foot uptake. Aiming for an automated analysis of the ratio of two vesicle types, clear core vesicles (CCVs) and dense core vesicles (DCVs), an extension for 3D ART VeSElecT was developed, integrating a machine-learning classifier. As a result, smaller vesicles and an increased amount of dense core vesicles in dauer larvae were found. In the third part of this thesis the developed software, designed for the analysis of synaptic vesicle pools, was checked for its suitability to recognize secretory vesicles in thrombocytes. Therefore, two-dimensional and three-dimensional transmission electron microscopic images were prepared and compared. The investigation has shown that a new methodology has to be developed which, although able to build on the previous work in principle, must meet the special challenges of image recognition of secretory vesicles from platelets.

Nichtlineare Verzerrungen von Rasterkraftmikroskopie (engl.: scanning probe microscopy, Abk.: SPM) Bildern beeinträchtigen die Qualität von Nanotomographiebildern und SPM Bildsequenzen. In dieser Arbeit wird ein neues, nichtlineares Registrierungsverfahren vorgestellt, das auf einem für medizinische Anwendungen entwickelten Algorithmus aufbaut und diesen für die Behandlung von SPM Daten erweitert. Die nichtlineare Registrierung ermöglicht es, verschiedene nanostrukturierte Materialen über große Bereiche (1 µm x 1 µm) mit einer Auflösung von 10 nm abzubilden. Dies erlaubt eine wesentlich detailliertere quantitative Analyse der Daten. Hierfür wurde eine neue Datenreduktions- und Visualisierungsmethode für Mikrodomänennetzwerke von Blockcopolymeren eingeführt. Zwei- und dreidimensionale Mikrodomänenstrukturen werden zu ihrem Skelett reduziert, Verzweigungspunkte farblich codiert und der entstandene Graph visualisiert. Die Anzahl verschiedener Skelettverzweigungen lässt sich über die Zeit verfolgen. Die Methode wurde mit lokalen Minkowskimaßen der ursprünglichen Graustufenbilder verglichen. Sie liefert morphologische und geometrische Informationen auf unterschiedlichen Längenskalen.

Zugl.: Kaiserslautern, Techn. Univ., Diss., 2009

Nichtlineare Verzerrungen von Rasterkraftmikroskopie (engl.: scanning probe microscopy, Abk.: SPM) Bildern beeinträchtigen die Qualität von Nanotomographiebildern und SPM Bildsequenzen. In dieser Arbeit wird ein neues, nichtlineares Registrierungsverfahren vorgestellt, das auf einem für medizinische Anwendungen entwickelten Algorithmus aufbaut und diesen für die Behandlung von SPM Daten erweitert. Die nichtlineare Registrierung ermöglicht es, verschiedene nanostrukturierte Materialen über große Bereiche (1 µm x 1 µm) mit einer Auflösung von 10 nm abzubilden. Dies erlaubt eine wesentlich detailliertere quantitative Analyse der Daten. Hierfür wurde eine neue Datenreduktions- und Visualisierungsmethode für Mikrodomänennetzwerke von Blockcopolymeren eingeführt. Zwei- und dreidimensionale Mikrodomänenstrukturen werden zu ihrem Skelett reduziert, Verzweigungspunkte farblich codiert und der entstandene Graph visualisiert. Die Anzahl verschiedener Skelettverzweigungen lässt sich über die Zeit verfolgen. Die Methode wurde mit lokalen Minkowskimaßen der ursprünglichen Graustufenbilder verglichen. Sie liefert morphologische und geometrische Informationen auf unterschiedlichen Längenskalen.