Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T21:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Saraiva_AntonioMarcos_D.pdf: 12032714 bytes, checksum: 1262a05ca10735e855fa138a2093d04b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A linhagem 9a5c da bactéria Xylella fastidiosa foi o primeiro fitopatógeno a ter seu genoma completamente sequenciado, o qual gerdu diversas informações sobre seu metabolismo e patogenicidade. Das orfs codificadas por esta bactéria, destaca-se; no presente trabalho, a XF0703, cuja proteína correlata (com 28,3 kDa) possui similaridade com proteínas SurE de várias outras bactérias. Proteínas SurEs são nucleotidases que desfosforilam diversos nucleosideos monofosforilados para seus respectivos nucleosideos. Tal função é de fundamental importância para manter o pool balanceado dos quatro (deoxi)ribonucleosideos para síntese de DNA e RNA, respectivamente. Este trabalho descreve a clonagem da orfXF0703 no vetor pET29a, a expressão da proteína recombinante (XfSurE) em Escheríchia coli BL21(DE3) e a purificação da mesma por cromatografia de afinidade ao níquel. A análise da estrutura secundária foi feita por dicroísmo circular e realizou-se a determinação do estado oligomérico por cromatografia de gel filtração e espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS), os quais revelaram que a proteína é um tetrâmero. Dados de caracterização funcional indicam que a proteína possui maior atividade em pH neutro na presença do íon manganês como cofator, com uma maior afinidade pelo substrato 3'-AMP (K0,5=0,16 mM). Além disso, ensaios cinéticos mostram que a proteína possui um comportamento alostérico com alta cooperatividade positiva (coeficiente de Hill em torno de 2,6) com todos os quatro substratos naturais testados (3'-AMP, 5'-dAMP, 5'-AMP e 5-GMP). Experimentos com a técnica de SAXS permitiram calcular o raio de giro (32,7 ± 0.2 A), distância máxima intramolecular (100 A) e a simetria do envelope da molécula (222). A estrutura de diversas SurEs homólogas já cristalizadas foram superpostas ao envelope obtido, sendo que StSurE (SurE de Salmonella com maior idenjidade de aminoácidos) mostrou ter o melhor ajuste. No entanto, notou-se que havia espaços vazios no envelope de XfSurE e tais espaços podiam ser preenchidos a partir do afastamento das alças responsáveis pela tetramerização e pela rotação dos f dímeros. Estes movimentos (translação e rotação) podem explicar o comportamento alostérico da proteína, facilitando a entrada de substrato ao sítio catalítico da molécula. / Abstract: The 9a5c strain from bacterium Xylella fastidiosa was the first phytopathogen to have its genome completely sequenced, which revealed a lot of information about its metabolism and its pathogenicity. 'From a variety of orfs encoded by this bacterium, we highlight, in this work, the XF0703, which correlated protein (with 28.3 kDa) has similarity with SurE proteins from several other bacteria. The SurE proteins *are nucleotidases that dephosphorylate various monophosphorylated nucleosides to their respective nucleosides. This function is critical for maintaining the balanced pool of four (deoxy) ribonucleosides for DNA and RNA synthesis. In this work, we describes the cloning of the XF0703 orf into the vector pET29a, the recombinant protein overexpression (XfSurE) in Escherichia coli BL21(DE3) and the protein purification by nickel affinity chromatography. The secondary structure analysis was done by circular dichroism, while oligomeric state determination was achieved by gel filtration chromatography and small-angle X-ray light scattering (SAXS), which showed that the protein is a tetramer. Functional characterization data indicate that the protein has a highest activity at neutral pH in the presence of manganese as a cofactor, with a highest affinity for the 3-AMP substrate (K0,5 = 0,16 mM). Furthermore, kinetic tests showed that the protein has a allosteric behavior with a high positive cooperativity (Hill coefficient around 2.6) for all natural substrates screened (3-AMP, 5'-dAMP, 5'-AMP and 5'-GMP). Experiments with SAXS technique have allowed to calculate the radius of gyration (32.7 ± 0.2 A), maximum intramolecular distance (100 A) and molecule symmetry. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular