Orientador: Adilson Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T10:37:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AndreLuizVettorede_D.pdf: 9002874 bytes, checksum: 1027adb35ed60662c9c5e7fa959bc387 (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Adilson Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T18:57:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_FelipeRodriguesda_M.pdf: 5917305 bytes, checksum: f5a2ce6dd1986e5219fe86f31267cb3c (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: As prolaminas, proteínas de reserva das sementes de cereais, são codificadas por uma série de genes regulados coordenativamente de forma específica ao nível de tecido e estágio de desenvolvimento. Estas proteínas são agrupadas em classes em função das similaridades na estrutura primária e conseqüente solubilidade. A expressão dos genes que as codificam é regulada principalmente ao nível da transcrição. As prolaminas de Coix são chamadas coixinas e representam mais de 70% do conteúdo protéico do endosperma. De acordo com sua solubilidade diferencial, as coixinas são classificadas em a e y-coixinas. Os dados moleculares obtidos até o momento indicam um alto grau de similaridade entre os genes que codificam as prolaminas de milho, Coix e sorgo. A expressão coordenada das prolaminas se dá através de mecanismos comuns a todas as classes. Entretanto, estudos recentes sobre a mutação opaco-2 mostram claramente que as a- e y prolaminas são reguladas também por um mecanismo exclusivo para estas classes. Tal fato sugere o envolvimento vários mecanismos regulando a transcrição dos genes de prolaminas. Devido principalmente à mutação opaco-2, os mecanismos envolvidos na regulação gênica das a-prolaminas são bem estudados. Pouco é conhecido sobre estes mecanismos nas y-prolaminas. Entretanto, enquanto as y-prolaminas são codificadas por, no máximo, dois genes, as «-prolaminas são codificadas por uma família muJtigênica. Tal fato torna as y-prolaminas modelos interessantes no melhoramento molecular de cereais. Nesta tese o gene da y-coixina (AGCX23.1) foi isolado de uma biblioteca genômica construída no fagemídeo Â-dash, utilizando-se um clone de cDNA de y-coixina como sonda. A seqüência da região promotora do gene foi alinhada com as seqüências dos promotores das y-prolaminas de milho e sorgo, revelando uma série de elementos conservados. Alguns destes e_mentos são semelhantes a elementos cis já descritos, como o prolamín box e os sítios de ligação dos fatores GCN4 de leveduras e C/EBP de animais. Experimentos de expressão transitória comprovaram que o promotor do gene da y-coixina é capaz de dirigir a expressão do gene da _-glicoronidase em endosperma imaturo de milho. A análise de deleção do promotor sugere que diversos elementos podem estar envolvidos na regulação de sua expressão. Experimentos de retardamento em gel provaram que três segmentos distintos do promotor da y-coixina ligam-se a fatores nucleares de maneira específica / Abstract: Prolamins, the major cereal storage proteins, are encoded by genes coordinately regulated in a tissue- and developmental stage-specific manner during seed development. There are several prolamin genes encoding proteins of discrete molecular sizes, which are divided in classes according to similarities in their primary structures and solubility. The expression of these genes is regulated primarily at the transcriptional level. The Coix prolamins, known as coixins, represent more than 70% of the total endosperm protein. Coixins can be separated in two fractions based on their differential solubility: (X- and y-coixins. The overall molecular data shows a high degree of similarity among the genes encoding the prolamins of maize, Coix and Sorghum. The coordinated expression of the prolamin genes is accomplished by a common regulatory mechanism. Still, recent studies on the opaque-2 mutation clearly demonstrated a distinct transcriptional regulation at the class level for the a- and p-prolamins. Therefore, multiple complex regulatory mechanisms are conceivably involved in the regulation of prolamin genes. Although the mechanisms of gene regulation for the a-prolamins are well studied, mostly because of the opaque-2 mutant of maize, little is known about the mechanisms controlling the y-prolamin genes. Also, while the a-prolamins are encoded by multigene families, the y-prolamíns are encoded by one or two genes, which heightens the importance of the y-prolamíns in molecular improving of cereais. In this work the y-coixin gene (I"GCX23.1) was isolated from a Coix genomic À-dash library. The library was screened using a y-coixin cDNA clone as probe. In order to elucidate the transcriptional regulation of the y-prolamin genes, the y-coixin promoter sequence was aligned with the promoter. sequences of the maize and sorghum y-prolamins genes. Several conserved motifs were found in the upstream region of these genes. Some of these motifs resembles cis-acting elements. such as the cereal prolamin box and the binding sites for yeast GCN4 and animal C/EBP transcriptional factors. Transient expression assays demonstrated the ability of the y-coixin promoter to drive the expression of the ß-glucuronidase reporter gene in immature maize endosperm. Deletion analysis of the promoter sequence suggested that several elements might be involved in its regulation. At least three distinct segments of the y-coixin promoter bind specifically to nuclear factors, as demonstrated by means of gel retardation assay / Mestrado / Genetica de Plantas / Mestre em Ciências

Orientador: Lucia Elvira Alvares / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:28:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grade_CarlaVermeulenCarvalho_D.pdf: 3007033 bytes, checksum: 522d9d385305f8744861d38f7dabf5aa (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A Miostatina é um regulador negativo da deposição de musculatura esquelética e mutações no gene que codifica esta proteína têm sido associadas a um aumento marcante na massa muscular de organismos vertebrados, resultado de hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares. Nosso grupo identificou previamente o promotor basal do gene da Miostatina e análises de bioinformática revelaram a presença de sítios evolutivamente conservados para a ligação de CREB, Meis, FXR e NFY, além de um sítio TATA. No presente trabalho nós utilizamos mutagênese sítio-dirigida para gerar diversas construções delecionais que possuem um ou mais sítios mutados, e testamos sua atividade in vitro usando mioblastos C2C12 de camundongo sob condições de proliferação e diferenciação, para analisar o papel destes sítios de ligação sobre a atividade do promotor. Os resultados mostraram que FXR aparentemente não confere efeito na atividade transcricional do promotor da Miostatina em ambos os momentos analisados, indicando que o papel regulador desta proteína pode estar relacionado ao controle da expressão da Miostatina em outro tipo celular, que não o mioblasto. O NFY apresentou um papel de ativador transcricional, enquanto CREB e Meis atuaram inicialmente como repressores durante a proliferação, passando a relaxar esta repressão durante a diferenciação dos mioblastos, permitindo que a atividade do promotor aumentasse significativamente. Trabalhando juntos, estes fatores de transcrição são capazes de manter a atividade do promotor em níveis mais baixos durante a proliferação dos mioblastos e, com o início da diferenciação, a repressão é liberada, e os níveis de atividade podem aumentar. Este padrão está de acordo com o padrão de expressão dinâmico observado para a proteína da Miostatina durante o desenvolvimento da musculatura esquelética em vertebrados / Abstract: Myostatin is a negative regulator of skeletal muscle deposition and mutations in the gene that encodes this protein have been associated to a remarkable increase in skeletal muscle mass, attributable to both hyperplasia and hypertrophy. We have previously identified Myostatin's basal promoter and bioinformatic analyses revealed the presence of evolutionarily conserved binding sites for CREB, Meis, FXR and NFY, besides a TATA box. In the present study we used site-directed mutagenesis to generate several expression constructs possessing one or more mutated sites, and tested their activity in vitro using mouse C2C12 myoblasts in proliferation and differentiation conditions, to analyze the role of these sites on the activity of the promoter. The results show that FXR appears not to confer any effect on the transcriptional activity of the promoter in both conditions, indicating that the regulatory role of this protein might be involved in the control of Myostatin expression in another cell type. NFY presents a role as transcriptional activator, while CREB and Meis act initially as repressors during proliferation, releasing this repression upon differentiation, which allows the activity of the promoter to significantly increase. Working together, these transcription factors are capable of maintaining the promoter activity at lower levels during the proliferation of myoblasts and, upon differentiation, the repression is released, and activity levels can be increased. This pattern is in agreement with the dynamic expression pattern observed for Myostatin during the skeletal muscle development in vertebrates / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural