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Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), remains a debilitating disease that affects the health of millions annually. Understanding its ability to persist within host and resist eradication by antibiotics is of utmost importance in the effort to develop new interventions. This study will focus on the transcriptional activator WhiB7 and its regulation of the multidrug Tap efflux pump encoded by Rv1258c. WhiB7 is thought to respond to redox stress induced by antibiotics and a variety of in vivo stresses by activating multiple genes including Rv1258c. Much remains to be determined regarding the role of WhiB7 and downstream genes in Mtb virulence and drug resistance. We will create a tool for studying WhiB7-mediated gene regulation by engineering a strain of the nonpathogenic bacterium Msm expressing the mCherry fluorescent protein controlled by the Rv1258c promoter. Knocking out the native WhiB7 gene in Msm via homologous recombination will allow clear introduction of wild type and mutant versions of Mtb WhiB7. Changes in the fluorescent activity of Rv1258c promoter fusion to mCherry will indicate the effects of WhiB7 mutagenesis. Secondly, we can also use this system to confirm additional genes identified by microarray analysis that are potentially regulated by WhiB7. This will be done by cloning other promoters in front of mCherry in the Msm strain containing wild-type Mtb WhiB7. Understanding WhiB7’s role in Mycobacterium tuberculosis macrophage survival and antibiotic resistance may provide new strategies for developing drugs that can lead to a cure.

O tratamento de infecções por Staphylococcus aureus tem sido problemático devido ao surgimento de cepas resistentes a múltiplios antibióticos. O antibiótico de escolha para o tratamento de infecções por S. aureus resistente a oxacilina é o glicopeptídeo vancomicina. Desde o primeiro isolamento de cepas com sensibilidade reduzida a vancomicina (VISA) em 1997, tem havido crescente preocupação com a disseminação da resistência a este antibiótico. Os mecanismos moleculares que levam à resistência de baixo nível a vancomicina ainda não foram elucidados. A detecção deste fenótipo na rotina de laboratório clínico é laboriosa, pois as técnicas disponíveis são de difícil execução e interpretação. Até agora, não há relato de transmissão horizontal de infecção por VISA, e todas as cepas com este fenótipo foram isoladas de pacientes que faziam o uso prolongado de vancomicina. Uma deficiência no locus regulador de genes acessórios (agr) foi postulado como fator de risco para a aquisição do fenótipo VISA por uma cepa sensível a este antibiótico. Para este estudo, foram selecionadas 47 cepas de S. aureus, com sensibilidades variadas a vancomicina, inclusive 5 cepas VISA isoladas no Brasil. Determinou-se nas cepas as concentrações inibitórias mínimas de vancomicina e oxacilina, a atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro e de coelho, a capacidade de aderir ao poliestireno e o polimorfismo do locus agr. Determinou-se a integridade do locus agr por PCR-RFLP e sequenciamento de bases em 13 cepas representativas das 47 estudadas. A integridade do locus regulador acessório sarA também foi avaliada por sequenciamento de bases nestas 13 cepas. Foram escolhidas 18 cepas sensíveis a vancomicina com variadas características fenotípicas e estas foram submetidas à indução de resistência a vancomicina através da passagem seriada em concentrações crescentes deste antibiótico. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6 µg/mL de vancomicina foi avaliada em 8 cepas através de ensaios de flutuação. Não observou-se correlação entre a aquisição de resistência a vancomicina com as atividades hemolíticas ou capacidade de adesão das cepas. A maioria das cepas (82,9%) apresentou-se como pertencente ao grupo polimórfico agr I, inclusive as cepas VISA. Duas cepas não conseguiram ser induzidas à resistência a vancomicina. O tempo levado para a aquisição de resistência não se correlacionou com nenhuma característica fenotípica ou genotípica de um grupo de cepas. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6µg/mL de vancomicina apresentou-se maior para uma cepa pertencente ao clone endêmico brasileiro (CEB) cujo locus agr pertence ao grupo I e não apresentou variação de acordo com funcionalidade ou tipo do locus agr. Apenas uma das cepas VISA apresentou uma mutação no locus agr que o torna disfuncional. Os loci agr das outras cepas estudadas apresentaram-se íntegros. O locus sarA das cepas estudadas apresentou-se íntegro e com polimorfismos funcionais agrupados de acordo com a linhagem clonal das cepas. Pôde-se concluir que a integridade funcional do locus agr não é uma condição sine qua non para a aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina por parte de uma cepa sensível a este antibiótico. O grupo polimórfico agr II não tem maior predisposição à aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina, como havia sido sugerido por alguns trabalhos disponíveis na literatura. / The treatment of staphylococcal infections has lately been a strenuous undertaking due to the resistance of Staphylococcus aureus to multiple antibiotics. The antimicrobial drug of choice for the treatment of methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the glycopeptide vancomycin. Since the first isolation of S. aureus with reduced susceptibility to vancomycin (VISA) in 1997, there has been growing concern as to the dissemination of this resistance phenotype among isolates of this species. The molecular mechanisms that result in low level resistance to vancomycin have not yet been completely elucidated. The correct detection of this phenotype in the clinical laboratory is tricky, for the techniques available for this purpose are hard to execute and interpret. Until now, lateral transmission (dissemination) of VISA has not been reported and all strains bearing this phenotype have been isolated from patients who had been making prolonged use of vancomycin. A deficiency in the accessory gene regulator (agr) has been proposed as a risk factor for the acquisition of a VISA phenotype by a susceptible strain. For this study, 47 nosocomial VISA strains, that had been isolated in another study, were used. These strains were isolated from multiple geographical regions of Brazil, and included 5 VISA strains. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of vancomycin and oxacillin, as well as haemolysis in sheep and rabbit agar, adhesion to polystyrene and agr polymorphism were determined in all of these strains. The integrity of the agr locus was determined by PCR-RFLP and by nucleotide sequencing in a sample of 13 strains chosen to be representative of the 47 strains studied. The integrity of the Staphylococcal accessory regulator sarA was also determined by nucleotide sequencing in these 13 strains. Another representative sample of 18 strains that were susceptible to vancomycin were submitted to induction of resistance to vancomycin by serial passage in increasing concentrations of this drug. The mutation rate of a mutation that leads to the ability of growing in a concentration of 6 µg/mL of vancomycin was determined for 8 strains by fluctuation assays. There was no correlation between the acquisition of resistance to vancomycin with either haemolysis or adhesion to polystyrene. Most strains (82.9%) bore a group I agr polymorphism, including all of the VISA strains. Two strains could not be induced to resistance. The time taken for each strain to acquire resistance to vancomycin did not correlate with any phenotypic or genotypic characteristic pertaining to a group of strains. The rate of mutation that leads to the ability of growing in 6µg/mL of vancomycin proved to be higher for a strain belonging to the Brazilian Endemic Clone (BEC) bearing an agr group I polymorphism, and did not vary according to presence or type of agr locus. Only one of the VISA strains presented a mutation in the agr locus that renders it disfunctional. The agr loci of the other strains studied presented themselves to be intact. The sarA loci of the strains evaluated were intact however presented functional polymorphisms that were groups according to the clonal lineage of the strains. It can thus be concluded that the functional integrity of the agr locus is not a sine qua non condition for the acquisition of low level resistance to vancomycin by a susceptible strain. Bearing of an agr group II polymorphism does not predispose a strain to acquire resistance to vancomycin, as has been previously suggested in literature.

O tratamento de infecções por Staphylococcus aureus tem sido problemático devido ao surgimento de cepas resistentes a múltiplios antibióticos. O antibiótico de escolha para o tratamento de infecções por S. aureus resistente a oxacilina é o glicopeptídeo vancomicina. Desde o primeiro isolamento de cepas com sensibilidade reduzida a vancomicina (VISA) em 1997, tem havido crescente preocupação com a disseminação da resistência a este antibiótico. Os mecanismos moleculares que levam à resistência de baixo nível a vancomicina ainda não foram elucidados. A detecção deste fenótipo na rotina de laboratório clínico é laboriosa, pois as técnicas disponíveis são de difícil execução e interpretação. Até agora, não há relato de transmissão horizontal de infecção por VISA, e todas as cepas com este fenótipo foram isoladas de pacientes que faziam o uso prolongado de vancomicina. Uma deficiência no locus regulador de genes acessórios (agr) foi postulado como fator de risco para a aquisição do fenótipo VISA por uma cepa sensível a este antibiótico. Para este estudo, foram selecionadas 47 cepas de S. aureus, com sensibilidades variadas a vancomicina, inclusive 5 cepas VISA isoladas no Brasil. Determinou-se nas cepas as concentrações inibitórias mínimas de vancomicina e oxacilina, a atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro e de coelho, a capacidade de aderir ao poliestireno e o polimorfismo do locus agr. Determinou-se a integridade do locus agr por PCR-RFLP e sequenciamento de bases em 13 cepas representativas das 47 estudadas. A integridade do locus regulador acessório sarA também foi avaliada por sequenciamento de bases nestas 13 cepas. Foram escolhidas 18 cepas sensíveis a vancomicina com variadas características fenotípicas e estas foram submetidas à indução de resistência a vancomicina através da passagem seriada em concentrações crescentes deste antibiótico. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6 µg/mL de vancomicina foi avaliada em 8 cepas através de ensaios de flutuação. Não observou-se correlação entre a aquisição de resistência a vancomicina com as atividades hemolíticas ou capacidade de adesão das cepas. A maioria das cepas (82,9%) apresentou-se como pertencente ao grupo polimórfico agr I, inclusive as cepas VISA. Duas cepas não conseguiram ser induzidas à resistência a vancomicina. O tempo levado para a aquisição de resistência não se correlacionou com nenhuma característica fenotípica ou genotípica de um grupo de cepas. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6µg/mL de vancomicina apresentou-se maior para uma cepa pertencente ao clone endêmico brasileiro (CEB) cujo locus agr pertence ao grupo I e não apresentou variação de acordo com funcionalidade ou tipo do locus agr. Apenas uma das cepas VISA apresentou uma mutação no locus agr que o torna disfuncional. Os loci agr das outras cepas estudadas apresentaram-se íntegros. O locus sarA das cepas estudadas apresentou-se íntegro e com polimorfismos funcionais agrupados de acordo com a linhagem clonal das cepas. Pôde-se concluir que a integridade funcional do locus agr não é uma condição sine qua non para a aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina por parte de uma cepa sensível a este antibiótico. O grupo polimórfico agr II não tem maior predisposição à aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina, como havia sido sugerido por alguns trabalhos disponíveis na literatura. / The treatment of staphylococcal infections has lately been a strenuous undertaking due to the resistance of Staphylococcus aureus to multiple antibiotics. The antimicrobial drug of choice for the treatment of methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the glycopeptide vancomycin. Since the first isolation of S. aureus with reduced susceptibility to vancomycin (VISA) in 1997, there has been growing concern as to the dissemination of this resistance phenotype among isolates of this species. The molecular mechanisms that result in low level resistance to vancomycin have not yet been completely elucidated. The correct detection of this phenotype in the clinical laboratory is tricky, for the techniques available for this purpose are hard to execute and interpret. Until now, lateral transmission (dissemination) of VISA has not been reported and all strains bearing this phenotype have been isolated from patients who had been making prolonged use of vancomycin. A deficiency in the accessory gene regulator (agr) has been proposed as a risk factor for the acquisition of a VISA phenotype by a susceptible strain. For this study, 47 nosocomial VISA strains, that had been isolated in another study, were used. These strains were isolated from multiple geographical regions of Brazil, and included 5 VISA strains. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of vancomycin and oxacillin, as well as haemolysis in sheep and rabbit agar, adhesion to polystyrene and agr polymorphism were determined in all of these strains. The integrity of the agr locus was determined by PCR-RFLP and by nucleotide sequencing in a sample of 13 strains chosen to be representative of the 47 strains studied. The integrity of the Staphylococcal accessory regulator sarA was also determined by nucleotide sequencing in these 13 strains. Another representative sample of 18 strains that were susceptible to vancomycin were submitted to induction of resistance to vancomycin by serial passage in increasing concentrations of this drug. The mutation rate of a mutation that leads to the ability of growing in a concentration of 6 µg/mL of vancomycin was determined for 8 strains by fluctuation assays. There was no correlation between the acquisition of resistance to vancomycin with either haemolysis or adhesion to polystyrene. Most strains (82.9%) bore a group I agr polymorphism, including all of the VISA strains. Two strains could not be induced to resistance. The time taken for each strain to acquire resistance to vancomycin did not correlate with any phenotypic or genotypic characteristic pertaining to a group of strains. The rate of mutation that leads to the ability of growing in 6µg/mL of vancomycin proved to be higher for a strain belonging to the Brazilian Endemic Clone (BEC) bearing an agr group I polymorphism, and did not vary according to presence or type of agr locus. Only one of the VISA strains presented a mutation in the agr locus that renders it disfunctional. The agr loci of the other strains studied presented themselves to be intact. The sarA loci of the strains evaluated were intact however presented functional polymorphisms that were groups according to the clonal lineage of the strains. It can thus be concluded that the functional integrity of the agr locus is not a sine qua non condition for the acquisition of low level resistance to vancomycin by a susceptible strain. Bearing of an agr group II polymorphism does not predispose a strain to acquire resistance to vancomycin, as has been previously suggested in literature.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 5 uppsatser.