Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear. / Understanding the cellular and molecular processes that determine the oocytes quality is one of the main challenges that persist in biology of reproduction. The acquisition of oocyte competence, and the role played by the follicular environment surrounding the gamete in its development potential are phenomena to be better understood. Follicular cells, especially the cumulus cells, certainly play a role in the oocyte competence acquisition in vivo. During in vitro maturation (IVM) of oocytes was observed expansion and mucification of granulosa cells forming the cumulus-oocyte complex (COC), due to the intense synthesis of extracellular matrix components. These changes in the appearance of cumulus are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization to occur. The expression of proteins associated with the extracellular matrix of cumulus cells may be under the influence of oocyte origin, and may also be related to the composition of the IVM medium. The aim of this work were 1) to evaluate the expression of gene transcripts coding for proteins hyaluronic acid synthase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and actin-b (ACTB) in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) not matured or submitted to IVM in media with different proteic supplements, and 2) assess the rates of nuclear maturation of oocytes subjected to different conditions of IVM. The COCs were obtained from ovaries collected from cows immediately after slaughter, morphologically selected and divided into three groups: G1: not matured COCs; G2: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with fetal calf serum (FCS); and G3: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with bovine serum albumin (BSA). IVM was performed at 39°C in 5% CO2 and maximum relative humidity for 22 to 24 hours. For extraction of total RNA of COCs samples, TRIzol® reagent was used. Total RNA was subjected to capture of specific mRNA by magnetic separation (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). The mRNAs were reverse-transcribed into cDNA using the RT-PCR to evaluate the expression patterns of transcripts. Some of the oocytes from G2 and G3 was stripped of cumulus cells, and subjected to staining with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The analysis of relative abundance of interest mRNAs showed a significant difference between the different groups tested for transcripts of HAS2 (p = 0.000), link protein 1 (p = 0.001), connexin 43 (p = 0.007) and actin-b (p = 0.011), being higher in the groups of COCs submitted to IVM in medium supplemented with FCS. The evaluation of nuclear morphology showed no significant differences between maturation rates of G2 and G3. In conclusion, the IVM in media supplemented with FCS or BSA showed differeces in HAS2, link protein 1, connexin 43 and actin-b transcripts expression of bovine COCs. However, the nuclear maturation rates of oocytes subjected to IVM in media with different proteic supplements was not affected.

O experimento 1 verificou o efeito de um protocolo de indução e sincronização de estros em novilhas sobre a cronologia das parições e a repetição de crias como primíparas. 194 novilhas Hereford e Braford foram divididas em 2 grupos: Tratamento, submetido a um protocolo misto de observação e sincronização de estros e inseminação artificial a tempo fixo (IATF); e Controle, submetido ao manejo convencional de inseminação artificial (IA). Ambos grupos foram submetidos a repasse por touros. O Experimento 2 avaliou o efeito de um pré-tratamento com norgestomet (NOR), prévio a um protocolo de sincronização para IATF em novilhas, sobre as taxas de prenhez, assim como os efeitos de características relacionadas com a reprodução. 74 novilhas Angus e cruzas, 18 e 24 meses de idade, com peso médio de 276 kg, condição corporal (CC) mínima de 3 (1-5) e avaliadas por ultra-som para o status ovariano, onde utilizaram-se somente novilhas 2 e 3 (1-3). Pesagens a cada 30 dias, desde os 60 dias anteriores aos serviços. Coletado sangue para dosagem de progesterona. Os animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu um implante com 6 mg de NOR, na orelha direita, permanecendo por 14 dias; e Controle, que não recebeu implante. Dez dias após a retirada dos implantes, todas as novilhas foram a um protocolo para IATF, com uma injeção de GnRH, 7 dias depois uma aplicação de prostaglandina (PGF) e 48 horas mais tarde, as IATF e outra aplicação de GnRH. Quatorze dias após iniciou-se repasse com 2 touros, por mais 45 dias. O Experimento 3 avaliou o efeito da suplementação com progestágeno (acetato de medroxi-progesterona; MAP) ou progesterona, anteriormente a um protocolo para IATF, e verificou o efeito de características associadas à reprodução de novilhas, e de distintos manejos alimentares sobre as taxas de prenhez. Utilizaram-se 102 novilhas Angus, cruzas Angus e Braford, 22-24 meses, peso médio 241 kg e CC mínima de 2,5. Pesagens a cada 30 dias, a partir dos 60 dias anteriores aos serviços e ultra-som para o status ovariano (1-3). Quarenta e cinco dias antes da estação foram divididas em 2 grupos, Sem Suplementação, com 27 novilhas exclusivamente sobre pastagem natural, e Com Suplementação, com 75 novilhas consumindo 1% do peso em concentrado. Coletas de sangue para dosagem de progesterona. Grupos novamente divididos em 3, para receber dispositivo com progesterona, ou uma esponja intravaginal com MAP, ambos por 10 dias. O grupo Controle não recebeu nenhum tratamento. Na retirada dos implantes, todas as novilhas receberam PGF, e 4 dias depois, foram a um protocolo para IATF, com 2 mg de benzoato de estradiol na colocação de uma esponja com MAP. Sete dias depois, a esponja foi retirada, sendo aplicada PGF, seguindo-se nova aplicação de BE 24 horas depois, e IATF 52-56 horas após a PGF. Observação de estros 2 vezes por dia, desde a PGF até a IATF. Passados 14 dias, iniciou repasse por 4 touros, durante 45 dias. O Experimento 4 avaliou o efeito da suplementação de novilhas de corte com gammaorizanol, sobre o desempenho reprodutivo, assim como o efeito de outras características sobre a reprodução. Utilizaram-se 84 novilhas Angus, Hereford, Braford e Angus x Hereford, com 24 meses, peso médio de 283 kg e CC ≥ 3. Pesagens a cada 30 dias, desde 60 dias antes até o início dos serviços, coletas de sangue para dosagem de progesterona. Duas avaliações da espessura de gordura subcutânea, sobre a região P8 por ultra-som, com intervalo de 30 dias. Animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu desde 45 dias antes até o início da estação reprodutiva, 150 ml/dia de gamma-orizanol junto à 1 kg de concentrado; e Controle, com 150 ml/dia de melaço, junto à 1 kg do mesmo concentrado. Observações de estros 2 vezes/dia e IA. Dez dias após aplicou-se PGF a todas ainda não observadas em estro, prosseguindo-se a observação e IA por mais 25 dias. Após, repasse por 2 touros por 45 dias. Diagnósticos de gestação por ultra-som, 30 dias após as IATF ou IA, e novamente, 30 dias depois de retirados os touros. No experimento 1, a porcentagem de prenhez na primeira estação reprodutiva foi semelhante para os 2 grupos. Entretanto, a repetição de crias nas primíparas do grupo Tratamento foi significativamente maior. No Experimento 2, não foram observadas diferenças entre as taxas de prenhez à IATF e final, e conforme a idade e o status ovariano. No Experimento 3, taxas de estro superiores para o grupo Progesterona em relação ao Progestágeno e Controle. Entretanto, taxas de prenhez semelhantes entre os grupos. Foi encontrada diferença entre o peso 24 dias antes dos serviços, para as novilhas que emprenharam em relação às que permaneceram vazias e para os pesos das novilhas ao final da temporada. As novilhas com status ovariano 2 e 3 foram mais pesadas em relação ao 1, mas as taxas de prenhez não diferiram com o status ovariano. O concentrado proporcionou superior GMD para o grupo Com Suplementação, mas sem diferenças para as taxas de prenhez. No Experimento 4, taxas de prenhez semelhantes para Tratamento e Controle. Novilhas prenhas foram as que acumularam maior quantidade de gordura na região P8. Concluindo, o manejo com sincronização de estros e IATF na primeira estação reprodutiva em novilhas, apesar de apresentar índices idênticos de prenhez ao final da temporada, proporcionou diferença significativa nos índices de prenhez na segunda estação. O pré-tratamento com norgestomet não proporcionou superiores taxas de prenhez em novilhas. Da mesma forma, o priming com progesterona ou MAP, não proporcionou taxas de prenhez superiores, assim como a utilização de suplementação alimentar. O peso corporal antes ou dos serviços, foi superior para as novilhas que emprenharam. Novilhas com status ovariano 2 e 3, foram mais pesadas. O fornecimento de gamma-orizanol não proporcionou superiores taxas de prenhez ou peso corporal, entretanto, novilhas que resultaram prenhas, acumularam maior quantidade de gordura antes da estação reprodutiva. / Experiment 1 verified the effect of an estrus synchronization protocol in heifers on parturition chronology and primiparous reproductive performance. 194 Hereford and Braford heifers were divided into 2 groups: Treatment group, submitted to an estrus observation and synchronization to fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol; and Control group, submitted to a conventional artificial insemination (AI) management. All groups were submitted to a bull’s clean-up period. Experiment 2 evaluated the norgestomet (NOR) priming effect, before a fixed-time artificial insemination protocol (FTAI) in heifers, on pregnancy rates, as well as the effects of reproductive related characteristics. 74 Angus and cross-bred heifers, 18 and 24 months old, with 276 kg of body weight, body condition score (BCS) minimum of 3 (1- 5), and ovarian status evaluated by US. Only the 2 or 3 class heifers were used (1-3). Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the reproductive period. Blood was collected for progesterone assay. Heifers were divided in 2 groups: Treatment group, that received an ear implant with 6 mg of NOR, in the right ear, removing it 14 days after; and Control group, did not receive the implant. Ten days after the implants removal, all heifers were submitted to FTAI protocol, which including a GnRH i.m. injection, 7 days after the prostaglandin (PGF) aplication, and 48 hours later, FTAI and a second GnRH injection. Fourteen days later, started a clean-up period with 2 bulls, for 45 days more. Experiment 3 evaluated the progestin (medroxiprogesterone acetate; MAP) or progesterone suplementation effect, before a FTAI protocol, and evaluated the effects of reproductive associated characteristics in heifers, and feeding managements over pregnancy rates. 102 Angus, cross-bred Angus and Braford heifers, 22-24 months old were used, with an average body weight of 241 kg, and a minimum BCS of 2,5. Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the breeding period and an ecography was performed to evaluate ovarian status. Fourty five days before the season, heifers were divided into 2 groups. Without Suplementation group, with 27 heifers, only over natural pastures, and With Suplementation group, with 75 heifers receiving suplementation (72% TDN and 15% GP) about 1% body weight. Blood was collected for progesterone assay. Groups were again divided into 3, to receive a progesterone device or an intravaginal MAP sponge, for 10 days. The Control group, not received the treatment. At the implants removal, all heifers received PGF, and 4 days later were submitted to a FTAI protocol, with 2 mg estradiol benzoate with an intravaginal MAP sponge aplication. Seven days later, the sponge was removed, and PGF was injected, with a new EB injection, 24 hours later, and FTAI 52-56 hours after PGF. Estrus was observed from PGF injection to FTAI. A clean-up period started 14 days after with 4 bulls, for more 45 days. Experiment 4 evaluated the gamma-orizanol suplementation effects and other reproductive associated characteristics on fertility of beef heifers. 84 Angus, Angus x Hereford, Hereford and Braford heifers, 24 months old were used, with an average body weight of 283 kg and BCS ≥ 3. Heifers were weighted at 30 days intervals, to register ADG, and blood samples were collected for progesterone assay. Two subcutaneous fat thickness ecographic evaluations were performed at P8 region, with a 30 days interval. Animals were divided into 2 groups: Treatment group, that received 150 ml/day of gammaorizanol with 1 kg of concentrate since 45 days before the reproductive season start ; and Control group, with 150 ml/day of molasses with 1 kg of concentrate during the same period. Estrus control was done twice for day with AI of estrous heifers. Ten days later PGF was applied to all heifers that did not show estrus. The AI management continued for 25 days. In sequence, a clean-up period with 2 bulls was performed for 45 days. Gestational diagnostics by ecography at 30 days after FTAI, and again at 30 days after bulls removal. In experiment 1, pregnancy rates were similar between groups after first reproductive season. However, the repetition of Treatment group was significantly higher. In Experiment 2, were not observed differences between groups in FTAI and final pregnancy rates, without differences for age or ovarian status In Experiment 3, Progesterone group presented the higher estrus rates than Progestin and Control groups. However, were not observed differences in pregnancy rates among the groups. At the same experiment, difference on weights before mating was found between the heifers that became pregnant compared to heifers that stayed non pregnant. Heifers with ovarian status 2 and 3 had higher average weight than heifers with status 1. The suplementation enhanced ADG in the With Suplementation group, but it did not produce differences on pregnancy rates. In Experiment 4, pregnancy rates were similar between groups. Heifers which became pregnant acumulated more fat amount in P8 region, during the treatment period. In conclusion, the first breeding season management with synchronization to FTAI in heifers, since being presented identical final pregnancy rates, produced signifficative differences on pregnancy rates in the second breeding season. The priming with norgestomet did not enhance pregnancy rates in beef heifers, as well the progesterone or progestin primings and the different feeding managements. Heifers with ovarian status 2 and 3, had higher body weights. Gamma-orizanol supplementation did not enhanced pregnancy rates, ADG neither body weight. Heifers that became pregnant, acumulated more fat amount on P8 region before the reproductive season.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O experimento 1 verificou o efeito de um protocolo de indução e sincronização de estros em novilhas sobre a cronologia das parições e a repetição de crias como primíparas. 194 novilhas Hereford e Braford foram divididas em 2 grupos: Tratamento, submetido a um protocolo misto de observação e sincronização de estros e inseminação artificial a tempo fixo (IATF); e Controle, submetido ao manejo convencional de inseminação artificial (IA). Ambos grupos foram submetidos a repasse por touros. O Experimento 2 avaliou o efeito de um pré-tratamento com norgestomet (NOR), prévio a um protocolo de sincronização para IATF em novilhas, sobre as taxas de prenhez, assim como os efeitos de características relacionadas com a reprodução. 74 novilhas Angus e cruzas, 18 e 24 meses de idade, com peso médio de 276 kg, condição corporal (CC) mínima de 3 (1-5) e avaliadas por ultra-som para o status ovariano, onde utilizaram-se somente novilhas 2 e 3 (1-3). Pesagens a cada 30 dias, desde os 60 dias anteriores aos serviços. Coletado sangue para dosagem de progesterona. Os animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu um implante com 6 mg de NOR, na orelha direita, permanecendo por 14 dias; e Controle, que não recebeu implante. Dez dias após a retirada dos implantes, todas as novilhas foram a um protocolo para IATF, com uma injeção de GnRH, 7 dias depois uma aplicação de prostaglandina (PGF) e 48 horas mais tarde, as IATF e outra aplicação de GnRH. Quatorze dias após iniciou-se repasse com 2 touros, por mais 45 dias. O Experimento 3 avaliou o efeito da suplementação com progestágeno (acetato de medroxi-progesterona; MAP) ou progesterona, anteriormente a um protocolo para IATF, e verificou o efeito de características associadas à reprodução de novilhas, e de distintos manejos alimentares sobre as taxas de prenhez. Utilizaram-se 102 novilhas Angus, cruzas Angus e Braford, 22-24 meses, peso médio 241 kg e CC mínima de 2,5. Pesagens a cada 30 dias, a partir dos 60 dias anteriores aos serviços e ultra-som para o status ovariano (1-3). Quarenta e cinco dias antes da estação foram divididas em 2 grupos, Sem Suplementação, com 27 novilhas exclusivamente sobre pastagem natural, e Com Suplementação, com 75 novilhas consumindo 1% do peso em concentrado. Coletas de sangue para dosagem de progesterona. Grupos novamente divididos em 3, para receber dispositivo com progesterona, ou uma esponja intravaginal com MAP, ambos por 10 dias. O grupo Controle não recebeu nenhum tratamento. Na retirada dos implantes, todas as novilhas receberam PGF, e 4 dias depois, foram a um protocolo para IATF, com 2 mg de benzoato de estradiol na colocação de uma esponja com MAP. Sete dias depois, a esponja foi retirada, sendo aplicada PGF, seguindo-se nova aplicação de BE 24 horas depois, e IATF 52-56 horas após a PGF. Observação de estros 2 vezes por dia, desde a PGF até a IATF. Passados 14 dias, iniciou repasse por 4 touros, durante 45 dias. O Experimento 4 avaliou o efeito da suplementação de novilhas de corte com gammaorizanol, sobre o desempenho reprodutivo, assim como o efeito de outras características sobre a reprodução. Utilizaram-se 84 novilhas Angus, Hereford, Braford e Angus x Hereford, com 24 meses, peso médio de 283 kg e CC ≥ 3. Pesagens a cada 30 dias, desde 60 dias antes até o início dos serviços, coletas de sangue para dosagem de progesterona. Duas avaliações da espessura de gordura subcutânea, sobre a região P8 por ultra-som, com intervalo de 30 dias. Animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu desde 45 dias antes até o início da estação reprodutiva, 150 ml/dia de gamma-orizanol junto à 1 kg de concentrado; e Controle, com 150 ml/dia de melaço, junto à 1 kg do mesmo concentrado. Observações de estros 2 vezes/dia e IA. Dez dias após aplicou-se PGF a todas ainda não observadas em estro, prosseguindo-se a observação e IA por mais 25 dias. Após, repasse por 2 touros por 45 dias. Diagnósticos de gestação por ultra-som, 30 dias após as IATF ou IA, e novamente, 30 dias depois de retirados os touros. No experimento 1, a porcentagem de prenhez na primeira estação reprodutiva foi semelhante para os 2 grupos. Entretanto, a repetição de crias nas primíparas do grupo Tratamento foi significativamente maior. No Experimento 2, não foram observadas diferenças entre as taxas de prenhez à IATF e final, e conforme a idade e o status ovariano. No Experimento 3, taxas de estro superiores para o grupo Progesterona em relação ao Progestágeno e Controle. Entretanto, taxas de prenhez semelhantes entre os grupos. Foi encontrada diferença entre o peso 24 dias antes dos serviços, para as novilhas que emprenharam em relação às que permaneceram vazias e para os pesos das novilhas ao final da temporada. As novilhas com status ovariano 2 e 3 foram mais pesadas em relação ao 1, mas as taxas de prenhez não diferiram com o status ovariano. O concentrado proporcionou superior GMD para o grupo Com Suplementação, mas sem diferenças para as taxas de prenhez. No Experimento 4, taxas de prenhez semelhantes para Tratamento e Controle. Novilhas prenhas foram as que acumularam maior quantidade de gordura na região P8. Concluindo, o manejo com sincronização de estros e IATF na primeira estação reprodutiva em novilhas, apesar de apresentar índices idênticos de prenhez ao final da temporada, proporcionou diferença significativa nos índices de prenhez na segunda estação. O pré-tratamento com norgestomet não proporcionou superiores taxas de prenhez em novilhas. Da mesma forma, o priming com progesterona ou MAP, não proporcionou taxas de prenhez superiores, assim como a utilização de suplementação alimentar. O peso corporal antes ou dos serviços, foi superior para as novilhas que emprenharam. Novilhas com status ovariano 2 e 3, foram mais pesadas. O fornecimento de gamma-orizanol não proporcionou superiores taxas de prenhez ou peso corporal, entretanto, novilhas que resultaram prenhas, acumularam maior quantidade de gordura antes da estação reprodutiva. / Experiment 1 verified the effect of an estrus synchronization protocol in heifers on parturition chronology and primiparous reproductive performance. 194 Hereford and Braford heifers were divided into 2 groups: Treatment group, submitted to an estrus observation and synchronization to fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol; and Control group, submitted to a conventional artificial insemination (AI) management. All groups were submitted to a bull’s clean-up period. Experiment 2 evaluated the norgestomet (NOR) priming effect, before a fixed-time artificial insemination protocol (FTAI) in heifers, on pregnancy rates, as well as the effects of reproductive related characteristics. 74 Angus and cross-bred heifers, 18 and 24 months old, with 276 kg of body weight, body condition score (BCS) minimum of 3 (1- 5), and ovarian status evaluated by US. Only the 2 or 3 class heifers were used (1-3). Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the reproductive period. Blood was collected for progesterone assay. Heifers were divided in 2 groups: Treatment group, that received an ear implant with 6 mg of NOR, in the right ear, removing it 14 days after; and Control group, did not receive the implant. Ten days after the implants removal, all heifers were submitted to FTAI protocol, which including a GnRH i.m. injection, 7 days after the prostaglandin (PGF) aplication, and 48 hours later, FTAI and a second GnRH injection. Fourteen days later, started a clean-up period with 2 bulls, for 45 days more. Experiment 3 evaluated the progestin (medroxiprogesterone acetate; MAP) or progesterone suplementation effect, before a FTAI protocol, and evaluated the effects of reproductive associated characteristics in heifers, and feeding managements over pregnancy rates. 102 Angus, cross-bred Angus and Braford heifers, 22-24 months old were used, with an average body weight of 241 kg, and a minimum BCS of 2,5. Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the breeding period and an ecography was performed to evaluate ovarian status. Fourty five days before the season, heifers were divided into 2 groups. Without Suplementation group, with 27 heifers, only over natural pastures, and With Suplementation group, with 75 heifers receiving suplementation (72% TDN and 15% GP) about 1% body weight. Blood was collected for progesterone assay. Groups were again divided into 3, to receive a progesterone device or an intravaginal MAP sponge, for 10 days. The Control group, not received the treatment. At the implants removal, all heifers received PGF, and 4 days later were submitted to a FTAI protocol, with 2 mg estradiol benzoate with an intravaginal MAP sponge aplication. Seven days later, the sponge was removed, and PGF was injected, with a new EB injection, 24 hours later, and FTAI 52-56 hours after PGF. Estrus was observed from PGF injection to FTAI. A clean-up period started 14 days after with 4 bulls, for more 45 days. Experiment 4 evaluated the gamma-orizanol suplementation effects and other reproductive associated characteristics on fertility of beef heifers. 84 Angus, Angus x Hereford, Hereford and Braford heifers, 24 months old were used, with an average body weight of 283 kg and BCS ≥ 3. Heifers were weighted at 30 days intervals, to register ADG, and blood samples were collected for progesterone assay. Two subcutaneous fat thickness ecographic evaluations were performed at P8 region, with a 30 days interval. Animals were divided into 2 groups: Treatment group, that received 150 ml/day of gammaorizanol with 1 kg of concentrate since 45 days before the reproductive season start ; and Control group, with 150 ml/day of molasses with 1 kg of concentrate during the same period. Estrus control was done twice for day with AI of estrous heifers. Ten days later PGF was applied to all heifers that did not show estrus. The AI management continued for 25 days. In sequence, a clean-up period with 2 bulls was performed for 45 days. Gestational diagnostics by ecography at 30 days after FTAI, and again at 30 days after bulls removal. In experiment 1, pregnancy rates were similar between groups after first reproductive season. However, the repetition of Treatment group was significantly higher. In Experiment 2, were not observed differences between groups in FTAI and final pregnancy rates, without differences for age or ovarian status In Experiment 3, Progesterone group presented the higher estrus rates than Progestin and Control groups. However, were not observed differences in pregnancy rates among the groups. At the same experiment, difference on weights before mating was found between the heifers that became pregnant compared to heifers that stayed non pregnant. Heifers with ovarian status 2 and 3 had higher average weight than heifers with status 1. The suplementation enhanced ADG in the With Suplementation group, but it did not produce differences on pregnancy rates. In Experiment 4, pregnancy rates were similar between groups. Heifers which became pregnant acumulated more fat amount in P8 region, during the treatment period. In conclusion, the first breeding season management with synchronization to FTAI in heifers, since being presented identical final pregnancy rates, produced signifficative differences on pregnancy rates in the second breeding season. The priming with norgestomet did not enhance pregnancy rates in beef heifers, as well the progesterone or progestin primings and the different feeding managements. Heifers with ovarian status 2 and 3, had higher body weights. Gamma-orizanol supplementation did not enhanced pregnancy rates, ADG neither body weight. Heifers that became pregnant, acumulated more fat amount on P8 region before the reproductive season.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O objetivo do trabalho foi relacionar a baixa produtividade com perdas corporais lactacionais, caracterizando o perfil das fêmeas propensas ao risco, estudar detalhadamente este grupo de fêmeas e avaliar possíveis alternativas para minimizar os efeitos do catabolismo. O primeiro experimento analisou fêmeas de diferentes ordens de parto (OP) e perda de peso na lactação. Houve efeito da interação entre ordem de parto e perda de peso na taxa de parto das fêmeas (P<0,05) em fêmeas OP1 e OP2. Não houve interação da classe de OP com classe de perda de peso (P>0,05) para IDE e total de leitões nascidos. Fêmeas OP1 apresentaram IDE mais longo e menor tamanho da leitegada no parto subsequente (P<0,05) em comparação às fêmeas OP2 e OP3-5. As perdas corporais na lactação não afetaram o IDE (P>0,05), mas reduziram o tamanho da leitegada do parto seguinte (P<0,05). Os resultados sugerem que as fêmeas mais jovens são mais sensíveis ao catabolismo, afetando o desempenho reprodutivo após o desmame. Além disso, perdas corporais lactacionais reduzem o tamanho da leitegada subsequente. O segundo experimento estudou o efeito do peso ao parto (PP) e consumo energético em relação à mantença (CEM) na lactação de fêmeas OP1 e OP2 no desempenho reprodutivo. O baixo CEM afetou as perdas corporais em ambas as OP (P<0,05). O peso ao parto não afetou o consumo alimentar em fêmeas OP1, mas influenciou a ingestão de OP2. A concentração sérica de NEFA foi influenciada pelo CEM em OP1 e OP2. Alto CEM de OP1 implicou em aumento de ureia. Em OP1, o tamanho da leitegada não foi afetado pelo PP ou CEM, mas foi reduzida em OP2 com baixo PP ou CEM. O terceiro trabalho investigou o efeito de atrasar o primeiro serviço de OP1 após o desmame com tratamento com altrenogest (ALT) ou cobertura do segundo estro após o desmame (SKIP), comparado à inseminação no primeiro estro (CON). A restrição alimentar de 60% na última semana de lactação induziu uma perda média de peso corporal de 17kg. Quanto maior foi o intervalo desmame-serviço, maior foi a recuperação do peso à inseminação. O grupo ALT foi mais síncrono na entrada ao estro após a retirada do produto. A taxa de prenhez foi maior no SKIP e CON. ALT teve maior peso de corpora lutea e níveis de progesterona até 120h pós-ovulação. Não foi observada diferenças na taxa de ovulação, embriões viáveis, sobrevivência embrionária, tamanho dos embriões ou volume de fluido placentário. Dependendo do sistema de produção, estas estratégias podem trazer benefícios econômicos, quando aplicadas com critério em fêmeas com maior risco à baixa produtividade, uma vez que custo deve ser considerado. / The aim of this work was to relate low productivity to lactational weight loss, identifying the profile of females with more risk, study in details this cohort of sows and evaluate possible alternatives to minimize the effects of catabolism. The first trial evaluated females of different parity order (PO) and weight loss during lactation. There was interaction effect between parity order and weight loss on farrow rate (P<0.05) in PO1 and PO2 females. There was no interaction between PO and weight loss class (P>0.05) on WEI and subsequent total born. PO1 females presented longer WEI and lower litter size on subsequent farrowing compared to PO2 and PO3-5 females. Weight loss did not affect WEI (P>0.05), but it was related to a decrease of litter size in the subsequent farrowing (P<0.05). Results suggest young females are more sensitive to catabolism, affecting reproductive performance post weaning. The second experiment studied the effect of body weight at farrowing (BWF) and energy intake related to maintenance (MEIM) during lactation on subsequent reproductive performance of PO1 and PO2 sows. Low MEIM affected body weight loss in both PO (P<0.05). BWF did not affect energy intake in PO1 sows but influenced the consumption in PO2 sows. Serum NEFA concentration was influenced by MEIM in PO1 and PO2 sows. High MEIM PO1 sows showed higher urea concentration. In PO1, litter size was not affected by BWF or MEIM but was reduced in PO2 with Low BWF or MEIM. Third trial investigated the effect of delayed breeding in weaned PO1 sows with altrenogest treatment (ALT) or breeding at second estrus after weaning (SKIP), compared to breeding at first estrus after weaning (CON). Feed restriction at 60% during last week of lactation induced 17kg of body weight loss. The longer weaning to service interval resulted in greater recover of body weight at breeding. ALT group was more synchronized in estrus after altrenogest withdrawal. Pregnancy rate was greater in SKIP and CON. ALT had higher corpora lutea weight and progesterone levels at 120h post-ovulation. No differences in ovulation rate, live embryos, embryo survival, embryo size, or placental fluid volume were detected. Depending on the production system, these strategies may offer economic benefits, when carefully applied in a cohort of females with more risk to low productivity, since costs must be considered.

Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear. / Understanding the cellular and molecular processes that determine the oocytes quality is one of the main challenges that persist in biology of reproduction. The acquisition of oocyte competence, and the role played by the follicular environment surrounding the gamete in its development potential are phenomena to be better understood. Follicular cells, especially the cumulus cells, certainly play a role in the oocyte competence acquisition in vivo. During in vitro maturation (IVM) of oocytes was observed expansion and mucification of granulosa cells forming the cumulus-oocyte complex (COC), due to the intense synthesis of extracellular matrix components. These changes in the appearance of cumulus are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization to occur. The expression of proteins associated with the extracellular matrix of cumulus cells may be under the influence of oocyte origin, and may also be related to the composition of the IVM medium. The aim of this work were 1) to evaluate the expression of gene transcripts coding for proteins hyaluronic acid synthase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and actin-b (ACTB) in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) not matured or submitted to IVM in media with different proteic supplements, and 2) assess the rates of nuclear maturation of oocytes subjected to different conditions of IVM. The COCs were obtained from ovaries collected from cows immediately after slaughter, morphologically selected and divided into three groups: G1: not matured COCs; G2: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with fetal calf serum (FCS); and G3: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with bovine serum albumin (BSA). IVM was performed at 39°C in 5% CO2 and maximum relative humidity for 22 to 24 hours. For extraction of total RNA of COCs samples, TRIzol® reagent was used. Total RNA was subjected to capture of specific mRNA by magnetic separation (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). The mRNAs were reverse-transcribed into cDNA using the RT-PCR to evaluate the expression patterns of transcripts. Some of the oocytes from G2 and G3 was stripped of cumulus cells, and subjected to staining with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The analysis of relative abundance of interest mRNAs showed a significant difference between the different groups tested for transcripts of HAS2 (p = 0.000), link protein 1 (p = 0.001), connexin 43 (p = 0.007) and actin-b (p = 0.011), being higher in the groups of COCs submitted to IVM in medium supplemented with FCS. The evaluation of nuclear morphology showed no significant differences between maturation rates of G2 and G3. In conclusion, the IVM in media supplemented with FCS or BSA showed differeces in HAS2, link protein 1, connexin 43 and actin-b transcripts expression of bovine COCs. However, the nuclear maturation rates of oocytes subjected to IVM in media with different proteic supplements was not affected.

O objetivo do trabalho foi relacionar a baixa produtividade com perdas corporais lactacionais, caracterizando o perfil das fêmeas propensas ao risco, estudar detalhadamente este grupo de fêmeas e avaliar possíveis alternativas para minimizar os efeitos do catabolismo. O primeiro experimento analisou fêmeas de diferentes ordens de parto (OP) e perda de peso na lactação. Houve efeito da interação entre ordem de parto e perda de peso na taxa de parto das fêmeas (P<0,05) em fêmeas OP1 e OP2. Não houve interação da classe de OP com classe de perda de peso (P>0,05) para IDE e total de leitões nascidos. Fêmeas OP1 apresentaram IDE mais longo e menor tamanho da leitegada no parto subsequente (P<0,05) em comparação às fêmeas OP2 e OP3-5. As perdas corporais na lactação não afetaram o IDE (P>0,05), mas reduziram o tamanho da leitegada do parto seguinte (P<0,05). Os resultados sugerem que as fêmeas mais jovens são mais sensíveis ao catabolismo, afetando o desempenho reprodutivo após o desmame. Além disso, perdas corporais lactacionais reduzem o tamanho da leitegada subsequente. O segundo experimento estudou o efeito do peso ao parto (PP) e consumo energético em relação à mantença (CEM) na lactação de fêmeas OP1 e OP2 no desempenho reprodutivo. O baixo CEM afetou as perdas corporais em ambas as OP (P<0,05). O peso ao parto não afetou o consumo alimentar em fêmeas OP1, mas influenciou a ingestão de OP2. A concentração sérica de NEFA foi influenciada pelo CEM em OP1 e OP2. Alto CEM de OP1 implicou em aumento de ureia. Em OP1, o tamanho da leitegada não foi afetado pelo PP ou CEM, mas foi reduzida em OP2 com baixo PP ou CEM. O terceiro trabalho investigou o efeito de atrasar o primeiro serviço de OP1 após o desmame com tratamento com altrenogest (ALT) ou cobertura do segundo estro após o desmame (SKIP), comparado à inseminação no primeiro estro (CON). A restrição alimentar de 60% na última semana de lactação induziu uma perda média de peso corporal de 17kg. Quanto maior foi o intervalo desmame-serviço, maior foi a recuperação do peso à inseminação. O grupo ALT foi mais síncrono na entrada ao estro após a retirada do produto. A taxa de prenhez foi maior no SKIP e CON. ALT teve maior peso de corpora lutea e níveis de progesterona até 120h pós-ovulação. Não foi observada diferenças na taxa de ovulação, embriões viáveis, sobrevivência embrionária, tamanho dos embriões ou volume de fluido placentário. Dependendo do sistema de produção, estas estratégias podem trazer benefícios econômicos, quando aplicadas com critério em fêmeas com maior risco à baixa produtividade, uma vez que custo deve ser considerado. / The aim of this work was to relate low productivity to lactational weight loss, identifying the profile of females with more risk, study in details this cohort of sows and evaluate possible alternatives to minimize the effects of catabolism. The first trial evaluated females of different parity order (PO) and weight loss during lactation. There was interaction effect between parity order and weight loss on farrow rate (P<0.05) in PO1 and PO2 females. There was no interaction between PO and weight loss class (P>0.05) on WEI and subsequent total born. PO1 females presented longer WEI and lower litter size on subsequent farrowing compared to PO2 and PO3-5 females. Weight loss did not affect WEI (P>0.05), but it was related to a decrease of litter size in the subsequent farrowing (P<0.05). Results suggest young females are more sensitive to catabolism, affecting reproductive performance post weaning. The second experiment studied the effect of body weight at farrowing (BWF) and energy intake related to maintenance (MEIM) during lactation on subsequent reproductive performance of PO1 and PO2 sows. Low MEIM affected body weight loss in both PO (P<0.05). BWF did not affect energy intake in PO1 sows but influenced the consumption in PO2 sows. Serum NEFA concentration was influenced by MEIM in PO1 and PO2 sows. High MEIM PO1 sows showed higher urea concentration. In PO1, litter size was not affected by BWF or MEIM but was reduced in PO2 with Low BWF or MEIM. Third trial investigated the effect of delayed breeding in weaned PO1 sows with altrenogest treatment (ALT) or breeding at second estrus after weaning (SKIP), compared to breeding at first estrus after weaning (CON). Feed restriction at 60% during last week of lactation induced 17kg of body weight loss. The longer weaning to service interval resulted in greater recover of body weight at breeding. ALT group was more synchronized in estrus after altrenogest withdrawal. Pregnancy rate was greater in SKIP and CON. ALT had higher corpora lutea weight and progesterone levels at 120h post-ovulation. No differences in ovulation rate, live embryos, embryo survival, embryo size, or placental fluid volume were detected. Depending on the production system, these strategies may offer economic benefits, when carefully applied in a cohort of females with more risk to low productivity, since costs must be considered.

Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear. / Understanding the cellular and molecular processes that determine the oocytes quality is one of the main challenges that persist in biology of reproduction. The acquisition of oocyte competence, and the role played by the follicular environment surrounding the gamete in its development potential are phenomena to be better understood. Follicular cells, especially the cumulus cells, certainly play a role in the oocyte competence acquisition in vivo. During in vitro maturation (IVM) of oocytes was observed expansion and mucification of granulosa cells forming the cumulus-oocyte complex (COC), due to the intense synthesis of extracellular matrix components. These changes in the appearance of cumulus are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization to occur. The expression of proteins associated with the extracellular matrix of cumulus cells may be under the influence of oocyte origin, and may also be related to the composition of the IVM medium. The aim of this work were 1) to evaluate the expression of gene transcripts coding for proteins hyaluronic acid synthase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and actin-b (ACTB) in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) not matured or submitted to IVM in media with different proteic supplements, and 2) assess the rates of nuclear maturation of oocytes subjected to different conditions of IVM. The COCs were obtained from ovaries collected from cows immediately after slaughter, morphologically selected and divided into three groups: G1: not matured COCs; G2: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with fetal calf serum (FCS); and G3: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with bovine serum albumin (BSA). IVM was performed at 39°C in 5% CO2 and maximum relative humidity for 22 to 24 hours. For extraction of total RNA of COCs samples, TRIzol® reagent was used. Total RNA was subjected to capture of specific mRNA by magnetic separation (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). The mRNAs were reverse-transcribed into cDNA using the RT-PCR to evaluate the expression patterns of transcripts. Some of the oocytes from G2 and G3 was stripped of cumulus cells, and subjected to staining with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The analysis of relative abundance of interest mRNAs showed a significant difference between the different groups tested for transcripts of HAS2 (p = 0.000), link protein 1 (p = 0.001), connexin 43 (p = 0.007) and actin-b (p = 0.011), being higher in the groups of COCs submitted to IVM in medium supplemented with FCS. The evaluation of nuclear morphology showed no significant differences between maturation rates of G2 and G3. In conclusion, the IVM in media supplemented with FCS or BSA showed differeces in HAS2, link protein 1, connexin 43 and actin-b transcripts expression of bovine COCs. However, the nuclear maturation rates of oocytes subjected to IVM in media with different proteic supplements was not affected.

O experimento 1 verificou o efeito de um protocolo de indução e sincronização de estros em novilhas sobre a cronologia das parições e a repetição de crias como primíparas. 194 novilhas Hereford e Braford foram divididas em 2 grupos: Tratamento, submetido a um protocolo misto de observação e sincronização de estros e inseminação artificial a tempo fixo (IATF); e Controle, submetido ao manejo convencional de inseminação artificial (IA). Ambos grupos foram submetidos a repasse por touros. O Experimento 2 avaliou o efeito de um pré-tratamento com norgestomet (NOR), prévio a um protocolo de sincronização para IATF em novilhas, sobre as taxas de prenhez, assim como os efeitos de características relacionadas com a reprodução. 74 novilhas Angus e cruzas, 18 e 24 meses de idade, com peso médio de 276 kg, condição corporal (CC) mínima de 3 (1-5) e avaliadas por ultra-som para o status ovariano, onde utilizaram-se somente novilhas 2 e 3 (1-3). Pesagens a cada 30 dias, desde os 60 dias anteriores aos serviços. Coletado sangue para dosagem de progesterona. Os animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu um implante com 6 mg de NOR, na orelha direita, permanecendo por 14 dias; e Controle, que não recebeu implante. Dez dias após a retirada dos implantes, todas as novilhas foram a um protocolo para IATF, com uma injeção de GnRH, 7 dias depois uma aplicação de prostaglandina (PGF) e 48 horas mais tarde, as IATF e outra aplicação de GnRH. Quatorze dias após iniciou-se repasse com 2 touros, por mais 45 dias. O Experimento 3 avaliou o efeito da suplementação com progestágeno (acetato de medroxi-progesterona; MAP) ou progesterona, anteriormente a um protocolo para IATF, e verificou o efeito de características associadas à reprodução de novilhas, e de distintos manejos alimentares sobre as taxas de prenhez. Utilizaram-se 102 novilhas Angus, cruzas Angus e Braford, 22-24 meses, peso médio 241 kg e CC mínima de 2,5. Pesagens a cada 30 dias, a partir dos 60 dias anteriores aos serviços e ultra-som para o status ovariano (1-3). Quarenta e cinco dias antes da estação foram divididas em 2 grupos, Sem Suplementação, com 27 novilhas exclusivamente sobre pastagem natural, e Com Suplementação, com 75 novilhas consumindo 1% do peso em concentrado. Coletas de sangue para dosagem de progesterona. Grupos novamente divididos em 3, para receber dispositivo com progesterona, ou uma esponja intravaginal com MAP, ambos por 10 dias. O grupo Controle não recebeu nenhum tratamento. Na retirada dos implantes, todas as novilhas receberam PGF, e 4 dias depois, foram a um protocolo para IATF, com 2 mg de benzoato de estradiol na colocação de uma esponja com MAP. Sete dias depois, a esponja foi retirada, sendo aplicada PGF, seguindo-se nova aplicação de BE 24 horas depois, e IATF 52-56 horas após a PGF. Observação de estros 2 vezes por dia, desde a PGF até a IATF. Passados 14 dias, iniciou repasse por 4 touros, durante 45 dias. O Experimento 4 avaliou o efeito da suplementação de novilhas de corte com gammaorizanol, sobre o desempenho reprodutivo, assim como o efeito de outras características sobre a reprodução. Utilizaram-se 84 novilhas Angus, Hereford, Braford e Angus x Hereford, com 24 meses, peso médio de 283 kg e CC ≥ 3. Pesagens a cada 30 dias, desde 60 dias antes até o início dos serviços, coletas de sangue para dosagem de progesterona. Duas avaliações da espessura de gordura subcutânea, sobre a região P8 por ultra-som, com intervalo de 30 dias. Animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu desde 45 dias antes até o início da estação reprodutiva, 150 ml/dia de gamma-orizanol junto à 1 kg de concentrado; e Controle, com 150 ml/dia de melaço, junto à 1 kg do mesmo concentrado. Observações de estros 2 vezes/dia e IA. Dez dias após aplicou-se PGF a todas ainda não observadas em estro, prosseguindo-se a observação e IA por mais 25 dias. Após, repasse por 2 touros por 45 dias. Diagnósticos de gestação por ultra-som, 30 dias após as IATF ou IA, e novamente, 30 dias depois de retirados os touros. No experimento 1, a porcentagem de prenhez na primeira estação reprodutiva foi semelhante para os 2 grupos. Entretanto, a repetição de crias nas primíparas do grupo Tratamento foi significativamente maior. No Experimento 2, não foram observadas diferenças entre as taxas de prenhez à IATF e final, e conforme a idade e o status ovariano. No Experimento 3, taxas de estro superiores para o grupo Progesterona em relação ao Progestágeno e Controle. Entretanto, taxas de prenhez semelhantes entre os grupos. Foi encontrada diferença entre o peso 24 dias antes dos serviços, para as novilhas que emprenharam em relação às que permaneceram vazias e para os pesos das novilhas ao final da temporada. As novilhas com status ovariano 2 e 3 foram mais pesadas em relação ao 1, mas as taxas de prenhez não diferiram com o status ovariano. O concentrado proporcionou superior GMD para o grupo Com Suplementação, mas sem diferenças para as taxas de prenhez. No Experimento 4, taxas de prenhez semelhantes para Tratamento e Controle. Novilhas prenhas foram as que acumularam maior quantidade de gordura na região P8. Concluindo, o manejo com sincronização de estros e IATF na primeira estação reprodutiva em novilhas, apesar de apresentar índices idênticos de prenhez ao final da temporada, proporcionou diferença significativa nos índices de prenhez na segunda estação. O pré-tratamento com norgestomet não proporcionou superiores taxas de prenhez em novilhas. Da mesma forma, o priming com progesterona ou MAP, não proporcionou taxas de prenhez superiores, assim como a utilização de suplementação alimentar. O peso corporal antes ou dos serviços, foi superior para as novilhas que emprenharam. Novilhas com status ovariano 2 e 3, foram mais pesadas. O fornecimento de gamma-orizanol não proporcionou superiores taxas de prenhez ou peso corporal, entretanto, novilhas que resultaram prenhas, acumularam maior quantidade de gordura antes da estação reprodutiva. / Experiment 1 verified the effect of an estrus synchronization protocol in heifers on parturition chronology and primiparous reproductive performance. 194 Hereford and Braford heifers were divided into 2 groups: Treatment group, submitted to an estrus observation and synchronization to fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol; and Control group, submitted to a conventional artificial insemination (AI) management. All groups were submitted to a bull’s clean-up period. Experiment 2 evaluated the norgestomet (NOR) priming effect, before a fixed-time artificial insemination protocol (FTAI) in heifers, on pregnancy rates, as well as the effects of reproductive related characteristics. 74 Angus and cross-bred heifers, 18 and 24 months old, with 276 kg of body weight, body condition score (BCS) minimum of 3 (1- 5), and ovarian status evaluated by US. Only the 2 or 3 class heifers were used (1-3). Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the reproductive period. Blood was collected for progesterone assay. Heifers were divided in 2 groups: Treatment group, that received an ear implant with 6 mg of NOR, in the right ear, removing it 14 days after; and Control group, did not receive the implant. Ten days after the implants removal, all heifers were submitted to FTAI protocol, which including a GnRH i.m. injection, 7 days after the prostaglandin (PGF) aplication, and 48 hours later, FTAI and a second GnRH injection. Fourteen days later, started a clean-up period with 2 bulls, for 45 days more. Experiment 3 evaluated the progestin (medroxiprogesterone acetate; MAP) or progesterone suplementation effect, before a FTAI protocol, and evaluated the effects of reproductive associated characteristics in heifers, and feeding managements over pregnancy rates. 102 Angus, cross-bred Angus and Braford heifers, 22-24 months old were used, with an average body weight of 241 kg, and a minimum BCS of 2,5. Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the breeding period and an ecography was performed to evaluate ovarian status. Fourty five days before the season, heifers were divided into 2 groups. Without Suplementation group, with 27 heifers, only over natural pastures, and With Suplementation group, with 75 heifers receiving suplementation (72% TDN and 15% GP) about 1% body weight. Blood was collected for progesterone assay. Groups were again divided into 3, to receive a progesterone device or an intravaginal MAP sponge, for 10 days. The Control group, not received the treatment. At the implants removal, all heifers received PGF, and 4 days later were submitted to a FTAI protocol, with 2 mg estradiol benzoate with an intravaginal MAP sponge aplication. Seven days later, the sponge was removed, and PGF was injected, with a new EB injection, 24 hours later, and FTAI 52-56 hours after PGF. Estrus was observed from PGF injection to FTAI. A clean-up period started 14 days after with 4 bulls, for more 45 days. Experiment 4 evaluated the gamma-orizanol suplementation effects and other reproductive associated characteristics on fertility of beef heifers. 84 Angus, Angus x Hereford, Hereford and Braford heifers, 24 months old were used, with an average body weight of 283 kg and BCS ≥ 3. Heifers were weighted at 30 days intervals, to register ADG, and blood samples were collected for progesterone assay. Two subcutaneous fat thickness ecographic evaluations were performed at P8 region, with a 30 days interval. Animals were divided into 2 groups: Treatment group, that received 150 ml/day of gammaorizanol with 1 kg of concentrate since 45 days before the reproductive season start ; and Control group, with 150 ml/day of molasses with 1 kg of concentrate during the same period. Estrus control was done twice for day with AI of estrous heifers. Ten days later PGF was applied to all heifers that did not show estrus. The AI management continued for 25 days. In sequence, a clean-up period with 2 bulls was performed for 45 days. Gestational diagnostics by ecography at 30 days after FTAI, and again at 30 days after bulls removal. In experiment 1, pregnancy rates were similar between groups after first reproductive season. However, the repetition of Treatment group was significantly higher. In Experiment 2, were not observed differences between groups in FTAI and final pregnancy rates, without differences for age or ovarian status In Experiment 3, Progesterone group presented the higher estrus rates than Progestin and Control groups. However, were not observed differences in pregnancy rates among the groups. At the same experiment, difference on weights before mating was found between the heifers that became pregnant compared to heifers that stayed non pregnant. Heifers with ovarian status 2 and 3 had higher average weight than heifers with status 1. The suplementation enhanced ADG in the With Suplementation group, but it did not produce differences on pregnancy rates. In Experiment 4, pregnancy rates were similar between groups. Heifers which became pregnant acumulated more fat amount in P8 region, during the treatment period. In conclusion, the first breeding season management with synchronization to FTAI in heifers, since being presented identical final pregnancy rates, produced signifficative differences on pregnancy rates in the second breeding season. The priming with norgestomet did not enhance pregnancy rates in beef heifers, as well the progesterone or progestin primings and the different feeding managements. Heifers with ovarian status 2 and 3, had higher body weights. Gamma-orizanol supplementation did not enhanced pregnancy rates, ADG neither body weight. Heifers that became pregnant, acumulated more fat amount on P8 region before the reproductive season.