As infestações por Rhipicephalus microplus, conhecido como o carrapato do boi, causam enormes prejuízos econômicos na produção de gado na região tropical e países subtropicais em todo o mundo. O método atual de controle do ectoparasito depende exclusivamente de produtos tóxicos como os acaricidas, que deixam resíduos no meio ambiente e seu uso contínuo tem provocado o aparecimento de carrapatos resistentes, sendo, portanto, de pouca eficácia. O grupo de pesquisa em carrapatos da FMRP-USP tria antígenos candidatos que foram testados em vacinação experimental feita em bovinos, utilizando formulação antigênica multicomponente. Baseando-se nos resultados do transcriptoma de leucócitos do sangue periférico de bovinos vacinados, que identificou genes diferencialmente expressos, cuja expressão é afetada pelas infestações e a partir do transcriptoma da pele de bovinos da raça Nelore e Holandês, o presente estudo tem objetivo avaliar, através da técnica Nanostring, genes que possam ser empregados em testes para identificar bovinos geneticamente resistentes ao carrapato e comparar com os dados já obtidos dos transcriptomas de sangue periférico e de pele. Foi analisada a expressão gênica de leucócitos de sangue periférico de vacas da raça holandesa pouco e muito infestada, e da raça nelore durante períodos de baixa e alta infestação natural por carrapatos. Os dados obtidos mostraram que a infestação modulou um número maior de genes nos holandeses muito infestados do que nas outras raças. De acordo com a análise funcional realizada dos genes diferencialmente expressos (DEGs) encontrados pode-se observar uma possível relação do perfil de expressão gênica dos holandeses com a imunidade inata, ao passo que o perfil de expressão gênica encontrado na raça nelore pode estar relacionado tanto com a imunidade inata quanto a imunidade adaptativa. Dessa forma, avaliando o perfil de resistência e suscetibilidade, este trabalho sugere que os genes CXCL6, S100A8 (Calgranulina A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 e CEBPE, podem ser possíveis assinaturas gênicas relacionadas a resistência ou suscetibilidade / Infestations with the cattle tick, Rhipicephalus microplus, cause huge economic losses in cattle production in tropical and subtropical countries worldwide. Control of ticks and tick-borne diseases of livestock depends almost exclusively of chemical control, such as use of acaricides, which leads to environmental concerns and due to their continued use, has generated resistance mechanisms in ticks, presenting steadily decreasing efficiency in controlling tick infestations. The research group of ticks of FMRP-USP selects new antigens that were tested in an experimental immunization, using a multicomponent antigen formulation. Based on the transcriptome results from peripheral blood leukocytes from vaccinated cattle, which identified genes whose expression is affected by infestations, and from the skin transcriptome of Nelore and Holstein bovine, the aim of this project is evaluate, by Nanostring technology, genes that may be used in tests to identify genetically resistant cattle to bovine tick and compare with the data already obtained from peripheral blood transcriptome and skin transcriptome. Gene expression was analyzed in peripheral blood of Holstein (much infested or less infested), and Nelore during periods of low and high natural infestation of ticks. The results showed that a greater number of genes were modulated in Holstein than the other breeds. According to the functional analysis of differentially expressed genes (DEGs) it can be observed a possible correlation from Holsteins profile with innate immunity, while the gene expression profile found in Nelore can be related both with the innate and adaptive immunity. Thus, evaluating the resistance and susceptibility profile, this work suggests that genes CXCL6, S100A8 (Calgranulin A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 and CEBPE may be possible gene signatures related to resistance or susceptibility.

As infestações por Rhipicephalus microplus, conhecido como o carrapato do boi, causam enormes prejuízos econômicos na produção de gado na região tropical e países subtropicais em todo o mundo. O método atual de controle do ectoparasito depende exclusivamente de produtos tóxicos como os acaricidas, que deixam resíduos no meio ambiente e seu uso contínuo tem provocado o aparecimento de carrapatos resistentes, sendo, portanto, de pouca eficácia. O grupo de pesquisa em carrapatos da FMRP-USP tria antígenos candidatos que foram testados em vacinação experimental feita em bovinos, utilizando formulação antigênica multicomponente. Baseando-se nos resultados do transcriptoma de leucócitos do sangue periférico de bovinos vacinados, que identificou genes diferencialmente expressos, cuja expressão é afetada pelas infestações e a partir do transcriptoma da pele de bovinos da raça Nelore e Holandês, o presente estudo tem objetivo avaliar, através da técnica Nanostring, genes que possam ser empregados em testes para identificar bovinos geneticamente resistentes ao carrapato e comparar com os dados já obtidos dos transcriptomas de sangue periférico e de pele. Foi analisada a expressão gênica de leucócitos de sangue periférico de vacas da raça holandesa pouco e muito infestada, e da raça nelore durante períodos de baixa e alta infestação natural por carrapatos. Os dados obtidos mostraram que a infestação modulou um número maior de genes nos holandeses muito infestados do que nas outras raças. De acordo com a análise funcional realizada dos genes diferencialmente expressos (DEGs) encontrados pode-se observar uma possível relação do perfil de expressão gênica dos holandeses com a imunidade inata, ao passo que o perfil de expressão gênica encontrado na raça nelore pode estar relacionado tanto com a imunidade inata quanto a imunidade adaptativa. Dessa forma, avaliando o perfil de resistência e suscetibilidade, este trabalho sugere que os genes CXCL6, S100A8 (Calgranulina A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 e CEBPE, podem ser possíveis assinaturas gênicas relacionadas a resistência ou suscetibilidade / Infestations with the cattle tick, Rhipicephalus microplus, cause huge economic losses in cattle production in tropical and subtropical countries worldwide. Control of ticks and tick-borne diseases of livestock depends almost exclusively of chemical control, such as use of acaricides, which leads to environmental concerns and due to their continued use, has generated resistance mechanisms in ticks, presenting steadily decreasing efficiency in controlling tick infestations. The research group of ticks of FMRP-USP selects new antigens that were tested in an experimental immunization, using a multicomponent antigen formulation. Based on the transcriptome results from peripheral blood leukocytes from vaccinated cattle, which identified genes whose expression is affected by infestations, and from the skin transcriptome of Nelore and Holstein bovine, the aim of this project is evaluate, by Nanostring technology, genes that may be used in tests to identify genetically resistant cattle to bovine tick and compare with the data already obtained from peripheral blood transcriptome and skin transcriptome. Gene expression was analyzed in peripheral blood of Holstein (much infested or less infested), and Nelore during periods of low and high natural infestation of ticks. The results showed that a greater number of genes were modulated in Holstein than the other breeds. According to the functional analysis of differentially expressed genes (DEGs) it can be observed a possible correlation from Holsteins profile with innate immunity, while the gene expression profile found in Nelore can be related both with the innate and adaptive immunity. Thus, evaluating the resistance and susceptibility profile, this work suggests that genes CXCL6, S100A8 (Calgranulin A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 and CEBPE may be possible gene signatures related to resistance or susceptibility.

Rhipicephalus micropulus, conhecido como carrapato dos bovinos, é um dos parasitas mais importantes para a pecuária, pois causa enormes prejuízos ao produtor. Esses prejuízos se estendem desde a ação espoliativa que o carrapato exerce nos seus hospedeiros até a transmissão de uma diversidade de patógenos. Os carrapatos utilizam vários estímulos térmicos, sonoros, visuais, gustativos, táteis e olfativos na fase de busca pelo hospedeiro. Essas substâncias são conhecidas como semioquímicos e podem atuar em indivíduos de uma mesma espécie como os ferormônios ou entre indivíduos de espécies diferentes como os alomônios e cairomônios. Nos bovinos, já se sabe que uma de suas lipocalinas pode atrair insetos, porém não é sabido se essa atração ocorre para R. microplus. Já é sabido que o carrapato consegue distinguir odores liberados entre bovinos das raças Nelore e Holandês Preto e Branco (HPB), sendo mais atraído para bovinos da raça Holandês. A lipocalina por ser uma proteína globular e estar associada com o transporte de pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como odorantes e esteroides, e pode favorecer a atração do R. microplus, uma vez que essa proteína bovina pode ligar a odorantes e desempenhar um papel fundamental na liberação de odores para o ambiente, que por sua vez pode atrair, ou não, o R. microplus. Existem diferentes níveis de infestação de carrapatos entre bovinos das raças Nelore e Holandês, bem como entre os sexos da mesma raça. Além disso, o período do ciclo de vida do bovino também pode influenciar na susceptibilidade a infestação, por exemplo, as vacas no período de lactação são consideradas mais susceptíveis ao parasito. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da lipocalina bovina na resistência e suscetibilidade ao carrapato, através da quantificação dessa proteína em líquidos corporais dos bovinos, tais como soro, saliva, urina, suor, secreção nasal e biopsia de pele obtidos de bovinos que apresentam fenótipos contrastantes de infestações, a saber: hospedeiros macho (touros) e fêmea (vacas em lactação) das raças resistentes (Bos indicus) e suscetíveis (Bos taurus). Os resultados deste trabalho tem demonstrado que a lipocalina bovina está presente em todos os fluídos investigados, exceto a urina, como observado por Western blot. Com os resultados deste trabalho podemos concluir que a bcOBP apresenta 9 diferença significativa nos fluidos de saliva e secreção nasal de touros e vacas em lactação da raça HPB quando comparados com touros e vacas em lactação da raça Nelore. Em amostras de biópsia de pele também ocorreu uma maior marcação da bcOBP na raça susceptível (HPB), demonstrando que a bcOBP possivelmente esta auxiliando na susceptibilidade destes bovinos ao carrapato, através do transporte de um maior número de odorantes que estariam atraindo um maior número de carrapatos. Ao analisar os fluidos entre bovinos da mesma raça, porém de sexo diferente, observou-se uma maior quantidade de bcOBP em vacas no período de lactação HPB nos fluidos de saliva e secreção nasal, visto que as vacas estão no período de lactação e são mais susceptíveis a infestações. Consequentemente, a bcOBP poderia estar colaborando para a sua maior susceptibilidade quando comparadas com touros HPB, e o mesmo ocorreu para biopsia de pele. Porém no fluído soro o aumento foi significativo para touro HPB quando comparado às vacas em lactação da raça HPB. Acredita-se que esse fenômeno ocorra devido ao período de lactação nas fêmeas uma vez que a produção da lipocalina bovina esta intimamente relacionada com a produção do leite. Os resultados deste trabalho demonstram que possivelmente a bcOBP na raça HPB está carreando odorantes para o ambiente os quais estariam atraindo mais carrapatos, e auxiliando na susceptibilidade destes bovinos. / Rhipicephalus micropulus, known as bovine tick, is one of the most important parasites for livestock, as they cause enormous damage to the producer. These demages extend from the spoliation action that the tick exerts on the skin of its hosts until the transmission of a diversity of pathogens. Ticks use various thermal, sound, visual, gustatory, tactile and olfactory stimuli in the search phase to the host. These substances are known as semiochemicals and can act within individuals of the same species as the pheromones or among individuals of different species such as alomones and cairomones. In the cattle, it is known that the lipocalin protein may attract insects, but this attraction is not known to influence the R. microplus. It is known that the tick can distinguish released odors between Nelore and Holstein cattle, being more attracted to cattle of the Holstein breed. Lipocalin, being a globular protein and associated with the transport of small hydrophobic molecules, such as odorants and steroids, can favor the attraction of R. microplus, since this bovine protein can bind to odorants and play a key role in the release of odors into the environment, which in turn may or may not attract R. microplus. There are different levels of tick infestation among cattle of the Nelore and Holstein breeds, as well as between the sexes of the same breed. In addition, the life cycle period of the bovine can also influence the susceptibility to infestation. For example, cows in the lactation period are considered more susceptible to the parasite. Thus, the objective of the present study was to evaluate the role of bovine lipocalin in the resistance and susceptibility to tick by quantifying that protein in bovine body fluids such as serum, saliva and urine, sweat, nasal secretions and skin biopsies obtained from resistant (Bos indicus) and susceptible (Bos taurus) cattle breeds. The results of this work have demonstrated that bovine lipocalin is present in all investigated fluids except urine, as observed by Western Blot. With the results of this work we can conclude that bcOBP presents a significant difference in fluids saliva and nasal secretion of bulls and cows in lactation breed HPB when compared to bulls and lactating cows of the Nelore breed. In skin biopsy specimens, there was also a greater labeling of bcOBP in the susceptible strain (HPB), which could then aid in the susceptibility of these cattle to the 11 tick, by transporting a larger number of odorants that would be attracting a greater number of ticks. When analyzing the fluids between bovines of the same breed, but of different sex, a greater amount of bcOBP was observed in cows during the period of HPB lactation in the fluids saliva and nasal secretion, since the cows are in the lactation period and are more susceptible to infestations. Consequently, bcOBP could be contributing to its greater susceptibility when compared to HPB bulls, and the same was done for skin biopsy. However, in the fluid serum, the increase was significant for the bull when compared to the lactating cows of the HPB race. It is believed that this phenomenon occurs due to the lactation period in females since the production of bovine lipocalin is closely related to milk production. The results of this work demonstrate that possibly Lipocalin in Holstein cattle is carrying odorants to the environment which would be attracting more ticks, and enhancing in the susceptibility of these cattle.

Rhipicephalus micropulus, conhecido como carrapato dos bovinos, é um dos parasitas mais importantes para a pecuária, pois causa enormes prejuízos ao produtor. Esses prejuízos se estendem desde a ação espoliativa que o carrapato exerce nos seus hospedeiros até a transmissão de uma diversidade de patógenos. Os carrapatos utilizam vários estímulos térmicos, sonoros, visuais, gustativos, táteis e olfativos na fase de busca pelo hospedeiro. Essas substâncias são conhecidas como semioquímicos e podem atuar em indivíduos de uma mesma espécie como os ferormônios ou entre indivíduos de espécies diferentes como os alomônios e cairomônios. Nos bovinos, já se sabe que uma de suas lipocalinas pode atrair insetos, porém não é sabido se essa atração ocorre para R. microplus. Já é sabido que o carrapato consegue distinguir odores liberados entre bovinos das raças Nelore e Holandês Preto e Branco (HPB), sendo mais atraído para bovinos da raça Holandês. A lipocalina por ser uma proteína globular e estar associada com o transporte de pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como odorantes e esteroides, e pode favorecer a atração do R. microplus, uma vez que essa proteína bovina pode ligar a odorantes e desempenhar um papel fundamental na liberação de odores para o ambiente, que por sua vez pode atrair, ou não, o R. microplus. Existem diferentes níveis de infestação de carrapatos entre bovinos das raças Nelore e Holandês, bem como entre os sexos da mesma raça. Além disso, o período do ciclo de vida do bovino também pode influenciar na susceptibilidade a infestação, por exemplo, as vacas no período de lactação são consideradas mais susceptíveis ao parasito. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da lipocalina bovina na resistência e suscetibilidade ao carrapato, através da quantificação dessa proteína em líquidos corporais dos bovinos, tais como soro, saliva, urina, suor, secreção nasal e biopsia de pele obtidos de bovinos que apresentam fenótipos contrastantes de infestações, a saber: hospedeiros macho (touros) e fêmea (vacas em lactação) das raças resistentes (Bos indicus) e suscetíveis (Bos taurus). Os resultados deste trabalho tem demonstrado que a lipocalina bovina está presente em todos os fluídos investigados, exceto a urina, como observado por Western blot. Com os resultados deste trabalho podemos concluir que a bcOBP apresenta 9 diferença significativa nos fluidos de saliva e secreção nasal de touros e vacas em lactação da raça HPB quando comparados com touros e vacas em lactação da raça Nelore. Em amostras de biópsia de pele também ocorreu uma maior marcação da bcOBP na raça susceptível (HPB), demonstrando que a bcOBP possivelmente esta auxiliando na susceptibilidade destes bovinos ao carrapato, através do transporte de um maior número de odorantes que estariam atraindo um maior número de carrapatos. Ao analisar os fluidos entre bovinos da mesma raça, porém de sexo diferente, observou-se uma maior quantidade de bcOBP em vacas no período de lactação HPB nos fluidos de saliva e secreção nasal, visto que as vacas estão no período de lactação e são mais susceptíveis a infestações. Consequentemente, a bcOBP poderia estar colaborando para a sua maior susceptibilidade quando comparadas com touros HPB, e o mesmo ocorreu para biopsia de pele. Porém no fluído soro o aumento foi significativo para touro HPB quando comparado às vacas em lactação da raça HPB. Acredita-se que esse fenômeno ocorra devido ao período de lactação nas fêmeas uma vez que a produção da lipocalina bovina esta intimamente relacionada com a produção do leite. Os resultados deste trabalho demonstram que possivelmente a bcOBP na raça HPB está carreando odorantes para o ambiente os quais estariam atraindo mais carrapatos, e auxiliando na susceptibilidade destes bovinos. / Rhipicephalus micropulus, known as bovine tick, is one of the most important parasites for livestock, as they cause enormous damage to the producer. These demages extend from the spoliation action that the tick exerts on the skin of its hosts until the transmission of a diversity of pathogens. Ticks use various thermal, sound, visual, gustatory, tactile and olfactory stimuli in the search phase to the host. These substances are known as semiochemicals and can act within individuals of the same species as the pheromones or among individuals of different species such as alomones and cairomones. In the cattle, it is known that the lipocalin protein may attract insects, but this attraction is not known to influence the R. microplus. It is known that the tick can distinguish released odors between Nelore and Holstein cattle, being more attracted to cattle of the Holstein breed. Lipocalin, being a globular protein and associated with the transport of small hydrophobic molecules, such as odorants and steroids, can favor the attraction of R. microplus, since this bovine protein can bind to odorants and play a key role in the release of odors into the environment, which in turn may or may not attract R. microplus. There are different levels of tick infestation among cattle of the Nelore and Holstein breeds, as well as between the sexes of the same breed. In addition, the life cycle period of the bovine can also influence the susceptibility to infestation. For example, cows in the lactation period are considered more susceptible to the parasite. Thus, the objective of the present study was to evaluate the role of bovine lipocalin in the resistance and susceptibility to tick by quantifying that protein in bovine body fluids such as serum, saliva and urine, sweat, nasal secretions and skin biopsies obtained from resistant (Bos indicus) and susceptible (Bos taurus) cattle breeds. The results of this work have demonstrated that bovine lipocalin is present in all investigated fluids except urine, as observed by Western Blot. With the results of this work we can conclude that bcOBP presents a significant difference in fluids saliva and nasal secretion of bulls and cows in lactation breed HPB when compared to bulls and lactating cows of the Nelore breed. In skin biopsy specimens, there was also a greater labeling of bcOBP in the susceptible strain (HPB), which could then aid in the susceptibility of these cattle to the 11 tick, by transporting a larger number of odorants that would be attracting a greater number of ticks. When analyzing the fluids between bovines of the same breed, but of different sex, a greater amount of bcOBP was observed in cows during the period of HPB lactation in the fluids saliva and nasal secretion, since the cows are in the lactation period and are more susceptible to infestations. Consequently, bcOBP could be contributing to its greater susceptibility when compared to HPB bulls, and the same was done for skin biopsy. However, in the fluid serum, the increase was significant for the bull when compared to the lactating cows of the HPB race. It is believed that this phenomenon occurs due to the lactation period in females since the production of bovine lipocalin is closely related to milk production. The results of this work demonstrate that possibly Lipocalin in Holstein cattle is carrying odorants to the environment which would be attracting more ticks, and enhancing in the susceptibility of these cattle.

Efficient control of sea lice is a major challenge for the sustainable production of farmed Atlantic salmon (Salmo salar (Linnaeus, 1758)). These marine ectoparasites feed on mucus, skin and blood of their hosts, thereby reducing the salmon’s growth rate and overall health. In the northern hemisphere, the most prevalent species is Lepeophtheirus salmonis (Krøyer, 1837). In 2006, global costs of sea lice infections are estimated to have exceeded €300 million, with the majority spent on a limited number of chemical delousing agents. Emamectin benzoate (EMB; SLICE®), an avermectin, has been widely used since its introduction in 2000, due to its convenient administration as an in-feed medication and its high efficacy against all parasitic stages of L. salmonis. However, over-reliance on a single or limited range of medicines favours the emergence of drug resistance and, as a result, the efficacy of this compound in treating L. salmonis has decreased in recent years, as reported from e.g. Chile, Norway, Scotland and Canada. Declining efficacy underlines the need for an improved understanding of the molecular mechanisms underlying EMB drug resistance in L. salmonis. Elucidation of these mechanisms would allow for improved monitoring tools, earlier detection of developing resistance, extended usability of current delousing agents and development of new parasiticides. The work described in this thesis sets out to examine the molecular mechanisms underlying EMB resistance in L. salmonis. In earlier studies, research in nematodes and arthropods has linked drug efflux transporters belonging to the family of ATP-binding cassette (ABC) transporters to ivermectin (IVM) resistance, a parasiticide with high chemical similarity to EMB. ABC transporters such as permeability glycoprotein (P-gp), transport a wide range of substrates, including drugs, and have been suggested to provide a potential molecular mechanism through which EMB resistance might be mediated in sea lice. As an example of such mechanisms, increased expression of P-gp is one of the causative factors for drug resistance in human cancer cells and avermectin resistance in nematode parasites such as Caenorhabditis elegans or Haemonchus contortus. Initial research involved screening for novel salmon lice P-gps that might contribute to EMB resistance. A novel P-gp, SL-PGY1, was discovered using a combined bioinformatic and molecular biological approach. The expression was compared in two well-characterised L. salmonis strains differing in their susceptibility to EMB (S = susceptible, R = resistant). Prior to EMB exposure, mRNA levels did not differ from each other, while, after 24 h exposure, a 2.9-fold increase in SL-PGY1 mRNA expression was observed in the R strain. SL-PGY1 appears not to be a major factor contributing to reduced EMB susceptibility, although it could play a role, as expression levels increased upon exposure to EMB. A further four additional drug transporters (ABC C subfamily) were also discovered showing high homology to multidrug-resistance proteins (MRP). The relative expression levels of each MRP was compared in the strains S and R, before and after exposure to EMB. No significant changes were found in their expression patterns. If ABC drug transporters mediate the efflux of EMB and thereby reduce the intracellular concentrations of the drug in exposed animals, the inhibition of those ABC drug transporters was expected to lead to higher intracellular levels of EMB. This could result in an enhanced toxic effect when EMB is co-administered with an inhibitor. Two known inhibitors of human P-gps and MRPs, cyclosporin A (CSA) and verapamil (VER), were co-administered with EMB. CSA increased the toxic effect of EMB in both tested strains, implying that the targets of CSA are expressed at comparable levels and that they may be part of the mechanism conferring EMB resistance. VER increased the toxic effect of EMB in the R strain, but had no significant effects on the S strain. This implies that the expression of factors inhibited by VER differs between the two L. salmonis strains. It is hypothesised that a number of ABC transporters with distinct, yet overlapping patterns of inhibitor specificity are affected by those inhibitors. The search for drug-resistance conferring genes was complemented with a systematic, genome-wide survey of ABC transporters in L. salmonis to find additional members of this important gene family. Next-generation high-throughput RNA sequencing (RNA-seq) was employed to assemble a reference transcriptome from pooled total RNA of salmon lice at different development stages. The transcriptome was assembled against the L. salmonis genome and annotated. Thirty-nine putative ABC transporters were found. Of further interest were transcripts of the subfamily B, C and G, as they contain drug-transporting ABC proteins. For the ABC B subfamily, one full (SL-PGY1) and three half transporter transcripts were found. Only full transporters are known to transport drugs and SL-PGY1 is apparently not a major factor contributing to EMB resistance. Fourteen ABCC sequences were found – 11 MRPs and 3 homologues to sulfonylurea receptors. Of interest are MRPs, as they contribute to drug detoxification in humans and invertebrates. Four MRPs had been identified previously and their expression ratios did not differ between S and R strain parasites. Seven sequences belonging to ABCG subfamily were found. However, none of the L. salmonis ABCG transcripts identified showed sufficient homology to known drug transporters in other species. With the currently limited understanding of the mechanisms conferring EMB resistance, monitoring the susceptibility of L. salmonis subpopulations is essential. Dose-response bioassays are currently widely used. Tests with pre-adult II or adult parasites requires relatively large numbers of parasites (~150) to conduct this type of bioassay, which may not always be available. Addressing this issue, we tested the feasibility of a single-dose bioassay (requiring fewer test animals than dose-response bioassays) to discriminate between L. salmonis strains with differing EMB susceptibility. This alternative approach uses time-course toxicity analysis, where the toxic effect of EMB is monitored over time. After clearly defining the effect criteria, we found that it is possible to discriminate between those L. salmonis strains. However, while requiring fewer test animals, time course toxicity analysis is more labour-intensive, but the alternative design can be suitable under certain circumstances. The work reported here has provided new knowledge concerning the mechanisms of EMB resistance in sea lice. Several novel putative drug transporters have been identified, an important first step toward unravelling the complex interactions of genes involved in EMB resistance in this commercially important parasite.