O nim (Azadirachta indica) é conhecido na Ásia devido a várias propriedades biológicas conhecidas desde a antigüidade. Os estudos referentes à ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim; não havendo, na literatura pesquisada, trabalhos relativos aos impactos causados sobre o sistema vegetal. As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos onde primeiro se manifestou a infecção, e este processo de morte celular programada envolve uma série de sinais que ainda não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foram estabelecidas as condições do meio de cultura de células de Rubus fruticosus para os estudos com extrato de sementes de nim, avaliado o efeito elicitor deste sobre a cultura. Foram obtidos extratos hidroalcoólicos E1 e E2 e suas respectivas frações lioflizadas, L1 e L2. Estes extratos apresentaram maior teor de açúcares e lipídeos em sua composição e revelaram potencial antioxidante. Detectou-se a presença de AZA-A em L1 e L2, por meio de CLAE, cujos teores foram de 5,03 e 1,1 mg/mL, respectivamente, com tempo de retenção em torno de 9,5 minutos, confirmado por meio de análises via espectrometria de massas. O extrato L2 foi fracionado nas frações L2 inicial e AZA2. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e destas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e suas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. As células de Rubus fruticosus (1,8g) foram incubadas em tampão citrato de sódio contendo o extrato L2 e as frações L2 inicial e AZA2, separadamente, até a concentração de 5 mg/mL, por 1h, em temperatura ambiente. Após este período, os compostos fenólicos, proteínas e açúcares redutores foram determinados no meio extracelular e intracelular por métodos colorimétricos. O efeito destas frações e do extrato L2, na produção de EROs em células intactas de Rubus fruticosus, foi analisado usando a sonda diacetato 2,7-diclorofluoresceína (LEE et al., 1999; MURATA et al., 2001). Os resultados obtidos indicam que AZA isolada não teve efeito sobre respostas de defesa. A fração L2 inicial teve aumento de fenólicos intracelulares, de açúcares redutores extracelulares e diminuição de EROs, com o aumento da concentração do elicitor, indicando potencial antioxidante e mecanismo de defesa. O extrato L2 também demonstrou potencial antioxidante e protetor das células com o aumento da concentração do elicitor, além de possuir ação inseticida. / The neem (Azadirachta indica) is known in Asia due to their several biological properties. The studies on the insecticide action of neem extracts have only been restrict to the insect mechanisms and their effects on rural workers; studies on the impact in the vegetable system are not available. The plants, like the other organisms, have the ability to self-defend against attack of patogens. The hypersensitive response (RH), a type of programmed cell death (PCD) in plants, is triggered by plant cells when they recognize the patogen, and is characterized by necrosis of tissues in the local region surrounding the infection; the signals involved are still not completely elucidated. The present study evaluated the effects of neem extracts in Rubus fruticosus cell. The powdered seeds were submitted to two consecutive extractions with ethanol:water (1:1, v/v) at room temperature for 10 minutes, yielding E1 and E2 fractions. The solvent was evaporated and the aqueous extracts were concentrated and lyophilized, resulting in two samples, L1 and L2. They are used for analyses by high performance liquid chromatograph (HPLC) in C-18 column (4.6 x 250 mm), with acetonitrile-water (4:6 v/v) as mobile phase, flow rate 1 mL/min, monitored at 214 nm. The principal compound of this fraction was azadirachtin (5.03 and 1.1 mg/mL, respectively), the retention time was 9.5 min; it was confirmed using mass spectrophotometry. The L2 extract was partially fractionated by high performance liquid chromatograph (HPLC) in semi preparative C-18 column. The main fractions, analyzed by colorimetric methods, ESI-MS, were L2 initial and AZA2. The Rubus fruticosus cells (18-21 days; 1.8 g) were incubated in sodium citrate buffer containing L2, L2 initial ans AZA2 at concentrations up to 5 mg/mL, for 1h, at room temperature. After this period, the phenolic compounds, proteins and reducing sugar were determined in the extracellular and intracellular medium by colorimetric methods. Also, the effects of these fractions over the production of reactive oxygen species (ROS) in intact cell of Rubus fruticosus, was analyzed using 2,7-dichloro-fluorescein diacetate. AZA2 had no effect on the defense response. The initial L2 fraction increased the phenolic compounds in the intracellular medium and the reducing sugars in the extracellular medium. The same fraction showed an inhibitory effect on ROS and also increased the concentration of the elicitor. These results indicate the antioxidant potential and protector effect of the L2 initial. The L2 extract also demonstrated antioxidant and protective potential of cells with the increase of the elicitor concentration. Therefore, in parallel with its insecticide action, the neem extract contributes to the self-defense ability of the plants.

O nim (Azadirachta indica) é conhecido na Ásia devido a várias propriedades biológicas conhecidas desde a antigüidade. Os estudos referentes à ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim; não havendo, na literatura pesquisada, trabalhos relativos aos impactos causados sobre o sistema vegetal. As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos onde primeiro se manifestou a infecção, e este processo de morte celular programada envolve uma série de sinais que ainda não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foram estabelecidas as condições do meio de cultura de células de Rubus fruticosus para os estudos com extrato de sementes de nim, avaliado o efeito elicitor deste sobre a cultura. Foram obtidos extratos hidroalcoólicos E1 e E2 e suas respectivas frações lioflizadas, L1 e L2. Estes extratos apresentaram maior teor de açúcares e lipídeos em sua composição e revelaram potencial antioxidante. Detectou-se a presença de AZA-A em L1 e L2, por meio de CLAE, cujos teores foram de 5,03 e 1,1 mg/mL, respectivamente, com tempo de retenção em torno de 9,5 minutos, confirmado por meio de análises via espectrometria de massas. O extrato L2 foi fracionado nas frações L2 inicial e AZA2. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e destas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e suas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. As células de Rubus fruticosus (1,8g) foram incubadas em tampão citrato de sódio contendo o extrato L2 e as frações L2 inicial e AZA2, separadamente, até a concentração de 5 mg/mL, por 1h, em temperatura ambiente. Após este período, os compostos fenólicos, proteínas e açúcares redutores foram determinados no meio extracelular e intracelular por métodos colorimétricos. O efeito destas frações e do extrato L2, na produção de EROs em células intactas de Rubus fruticosus, foi analisado usando a sonda diacetato 2,7-diclorofluoresceína (LEE et al., 1999; MURATA et al., 2001). Os resultados obtidos indicam que AZA isolada não teve efeito sobre respostas de defesa. A fração L2 inicial teve aumento de fenólicos intracelulares, de açúcares redutores extracelulares e diminuição de EROs, com o aumento da concentração do elicitor, indicando potencial antioxidante e mecanismo de defesa. O extrato L2 também demonstrou potencial antioxidante e protetor das células com o aumento da concentração do elicitor, além de possuir ação inseticida. / The neem (Azadirachta indica) is known in Asia due to their several biological properties. The studies on the insecticide action of neem extracts have only been restrict to the insect mechanisms and their effects on rural workers; studies on the impact in the vegetable system are not available. The plants, like the other organisms, have the ability to self-defend against attack of patogens. The hypersensitive response (RH), a type of programmed cell death (PCD) in plants, is triggered by plant cells when they recognize the patogen, and is characterized by necrosis of tissues in the local region surrounding the infection; the signals involved are still not completely elucidated. The present study evaluated the effects of neem extracts in Rubus fruticosus cell. The powdered seeds were submitted to two consecutive extractions with ethanol:water (1:1, v/v) at room temperature for 10 minutes, yielding E1 and E2 fractions. The solvent was evaporated and the aqueous extracts were concentrated and lyophilized, resulting in two samples, L1 and L2. They are used for analyses by high performance liquid chromatograph (HPLC) in C-18 column (4.6 x 250 mm), with acetonitrile-water (4:6 v/v) as mobile phase, flow rate 1 mL/min, monitored at 214 nm. The principal compound of this fraction was azadirachtin (5.03 and 1.1 mg/mL, respectively), the retention time was 9.5 min; it was confirmed using mass spectrophotometry. The L2 extract was partially fractionated by high performance liquid chromatograph (HPLC) in semi preparative C-18 column. The main fractions, analyzed by colorimetric methods, ESI-MS, were L2 initial and AZA2. The Rubus fruticosus cells (18-21 days; 1.8 g) were incubated in sodium citrate buffer containing L2, L2 initial ans AZA2 at concentrations up to 5 mg/mL, for 1h, at room temperature. After this period, the phenolic compounds, proteins and reducing sugar were determined in the extracellular and intracellular medium by colorimetric methods. Also, the effects of these fractions over the production of reactive oxygen species (ROS) in intact cell of Rubus fruticosus, was analyzed using 2,7-dichloro-fluorescein diacetate. AZA2 had no effect on the defense response. The initial L2 fraction increased the phenolic compounds in the intracellular medium and the reducing sugars in the extracellular medium. The same fraction showed an inhibitory effect on ROS and also increased the concentration of the elicitor. These results indicate the antioxidant potential and protector effect of the L2 initial. The L2 extract also demonstrated antioxidant and protective potential of cells with the increase of the elicitor concentration. Therefore, in parallel with its insecticide action, the neem extract contributes to the self-defense ability of the plants.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Interações como a herbivoria há o consumo de partes de tecidos vegetais por insetos herbívoros que promovem impactos no desempenho vegetativo e reprodutivo de plantas hospedeiras. Mecanismos de defesas induzidas como respostas de hipersensibilidade (RH) são observadas em diversas espécies e têm relação direta com a especificidade entre inseto herbívoro e planta hospedeira. No entanto, a capacidade de desenvolver RH varia de acordo com o genótipo e fenótipos de plantas hospedeiras e com distúrbios ambientais como o fogo. Assim, o objetivo geral do nosso estudo foi avaliar o desempenho de Bauhinia brevipes, a capacidade de desenvolver defesas induzidas contra o inseto galhador Schizomyia macrocapillata e as taxas de herbivoria por insetos de vida livre. Avaliamos essas interações no contexto das variações fenotípicas em desenvolver respostas de hipersensibilidade, e de distúrbios ambientais como o fogo. Assim, no primeiro capítulo, avaliamos o desempenho de plantas adultas e da progênie de acordo com os fenótipos de resistência (resistente e susceptível) aos ataques de S. macrocapillata. Para tal, avaliamos o desempenho vegetativo como arquitetura e o desempenho reprodutivo como número de sementes (componente feminino), o número de frutos formados (componente masculino) e a qualidade nutricional (macro e micronutrientes) em indivíduos resistentes e susceptíveis. Além disso, avaliamos o desempenho da prole em três estágios de desenvolvimento: sementes, plântulas e juvenis. Não houve diferenças nos desempenhos vegetativo e reprodutivo das plantas adultas, bem como na relação entre macro e micronutrientes e o fator resistência entre os fenótipos. Além disso, as taxas de germinação e investimentos em porção aérea e subterrânea na prole dos diferentes fenótipos foram similares. Acreditamos que a baixa incidência de S. macrocapillata sobre a população de B. brevipes contribuiu para o desempenho similar entre os fenótipos. Além disso, estratégias como tolerância à herbivoria devem ser analisadas nesse sistema inseto galhador / planta hospedeira. No segundo capítulo, avaliamos como as interações entre herbívoros e plantas hospedeiras, no contexto das defesas induzidas, como RH e defesas mecânicas como o acúmulo de silício em plantas com diferentes respostas ao fogo. Verificamos os indivíduos da população de B. brevipes apresentaram diferentes características quanto à incidência de fogo. As plantas que não rebrotaram apresentaram maiores taxas de herbivoria por insetos mastigadores e menores conteúdos de silício em relação às rebrotas. Por outro lado, as rebrotas foram mais atacadas por S. macrocapillata, mas exibiram maiores quantidades RH que àquelas plantas que não rebrotaram e em relação à estação anterior. Acreditamos que rebrotas de B. brevipes podem ser mais bem defendidas uma vez que alocam mais nutrientes, como nitrogênio para o crescimento e silício que reduz o desempenho de insetos mastigadores. As RH também podem ser aumentadas pela alocação de recursos pós-fogo o que levou às maiores taxas de defesas entre as rebrotas. Este estudo forneceu evidencias sobre o papel do fogo nas interações entre plantas hospedeiras e insetos de diferentes guildas e possíveis alterações no comportamento de insetos mastigadores. / In interactions such as herbivory the consumption of plant tissue by herbivore insects promotes several impacts on vegetative and reproductive performance of host plants. Defense mechanisms induced as hypersensitive response (HR) are observed in several species and is directly related to the specificity of herbivore insects and host plants. However, the ability to develop HR varies according to genotype and phenotype of plant hosts and with environmental disturbances such as fire. Thus, we aimed evaluate the performance of Bauhinia brevipes, the ability to evolve induced defenses against gall insect Schizomyia macrocapillata and herbivory rates by free-living insects. We analyzed these interactions in the context of phenotypic variation of resistance and environmental disturbances as fire. Then, in the first chapter, we evaluated the performance of mature plants and offspring according to the phenotypic resistance (resistant and susceptible) to S. macrocapillata attacks. Thus, we evaluate vegetative performance as architecture and reproductive performance as number of seeds (female component), the number of fruits (male component) and the nutritional quality (macro and micronutrients in leaves) on resistant and susceptible individuals. In addition, we evaluated the performance of the offspring in three stages of development: seeds, seedlings and juveniles. There were no differences in vegetative and reproductive performances of mature plants from resistant and susceptible phenotypes. Besides, there was no relationship between macro and micronutrients and the resistance factor. Germination rates and investments in shoot and root portion in the offspring of different phenotypes were similar. We believe that the low incidence of S. macrocapillata on the population of B. brevipes contributed to the similar performance between phenotypes. Moreover, strategies such as tolerance to herbivory should be analyzed in this gall insect / plant host system. In the second chapter, we evaluate the differences in responses to fire effects in relation to interactions between herbivore insects and host plants in and induced defenses (HR and silicon content). We detected an individual variation in response to fire as resprouting and non-resprouting plants in the population of B. brevipes. Non-resprouting plants showed higher rates of herbivory by chewing insects and lower silicon content in relation to resprouting. Contrasting, resprouting presented greater attack rate by S. macrocapillata, but exhibited larger amounts of HR than non- resprouting. We believe that resprouting of B. brevipes can be better defended, since allocate more nutrients such as nitrogen for growth and silicon which reduces the performance of chewing insects. HR can also be increased by the allocation of resources post-fire, which lead to the greatest defenses rates among resprouting plants. This study provided evidences about the role of fire in the interactions between host plants and insects of different guilds and possible changes in the behavior of chewing insects. / Dissertação (Mestrado)