Rhodobacter capsulatus is a versatile organism capable of growing on different growth conditions including photofermentation in the presence of carbon source, aerobic respiration, anaerobic respiration in the presence of an external electron acceptor such as DMSO. The photofermentative growth of R.capsulatus results in hydrogen production which stands out as an environmentally harmless method to produce hydrogen and accepted as one of the most promising process. Due to the serious problems such as as global climate change and environmental pollution caused by the fossil fuels, there is an increasing requirement for a clean and sustainable energy source. Furtherrmore, the ability of R.capsulatus to fix nitrogen, to use solar energy makes it a model to study various aspects of its metabolism. Thus the goal of this study is to increase the potential in biohydrogen production with the photofermentative bacteria and to investigate the proteins playing roles in different growth modes of the bacteria. In the present study, protein profiles of Rhodobacter capsulatus grown on respiratory, anaerobic respiratory and photofermentative growth modes were obtained. LC-MS/MS system is used to analyze the proteome as a high throughput technique. Physiological analysis such as HPLC for the analysis of the carbon source consumption, GC and analysis of pigments were carried out to state the environmental conditions. As a result, total of 460 proteins were identified with 17 proteins being unique to particular growth condition. Ratios of the proteins in different growth conditions were compared and important proteins were highlighted.

Dans cette thèse, le processus d'assemblage ainsi que la maturation du cytochrome c oxydase de type cbb3 (cbb3-Cox) ont été étudiés dans la proteobactérie phototrophique pourpe non soufrée Rhodobacter capsulatus. R. capsulatus contient une chaîne de transfert d'électrons très ramifiée et represente un modèle d’organisme très utilisé dans l'étude des processus respiratoires et photosynthétiques.Les cbb3-Coxs spécifiques des bactéries représentent la deuxième catégorie la plus abondante des cytochromes c oxydases après le type Cox-aa3, mais n'ont jusqu'à présent pas été étudiées en détail. Récemment, la première structure cristalline cbb3-Cox de P. stutzeri a été obtenue, fournissant ainsi une avancée majeure invitant à des etudes plus détaillées sur le mécanisme catalytique et le processus d'assemblage. Les études sur les procédés d'assemblage et de maturation sont d'une très grande importance en raison du fait que de nombreux agents pathogènes humains tels que Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis ou Campylobacter jejuni utilisent ce type de Cox, ce qui par conséquent pourrait amener a développer une interessante cible thérapeutique.Cbb3-Cox dans R. capsulatus est encodé par le gène opéron ccoNOQP codant quatre protéines membranaires constitutives de cbb3-Cox. CcoP et CcoO sont des cytochromes de type c, contenant des motifs périplasmiques fixés à l’hème. CcoN est la sous-unité centrale catalytique contenant deux molécules d’hèmes de type b et un ion cuivre. L’étude de la distribution de l’ion Cu à la sous-unité CcoN et l'assemblage des quatre sous-unités dans le complexe actif cbb3-Cox complexe sont les thèmes principaux de ce travail.Ici, le rôle du facteur d'assemblage putatif CcoH, sa structure et son interaction avec cbb3-Cox ont été étudiés en détail. CcoH est une petite protéine membranaire codé dans le groupe de gènes ccoGHIS situé à proximité des gènes codant cbb3-Cox. L'analyse in vivo de la formation de cbb3-Cox dans une souche ne contenant pas le facteur CcoH a montré une absence totale de cbb3-Cox. De même, la stabilité du facteur CcoH a été considérablement altérée dans une souche avec deletion du gene ccoNOQP. La dépendance mutuelle des deux protéines suggère leur interaction directe, ce qui a été confirmé par la photoréticulation directe de CcoH à la sous-unité CcoN, l’immunodétection de CcoH dans les cbb3-Cox complexes sur gels Blue Native, la co-purification par marquage CcoH-cbb3-Cox et le marquage radioactive in vitro des complexes cbb3-Cox avec CcoH.[...] / In this thesis, the assembly and maturation process of the cbb3-type cytochrome c oxidase (cbb3-Cox) was studied in the purple-non-sulphur phototrophic α-proteobacterium Rhodobacter capsulatus. R. capsulatus contains a highly branched electron-transfer chain and is a well studied model organism for investigating respiratory and photosynthetic processes.The bacteria-specific cbb3-Coxs represent the second most abundant class of cytochrome c oxidases after the aa3-type Cox, but have so far not been investigated in much detail. Recently, the first crystal structure of cbb3-Cox from P. stutzeri was obtained, providing a major breakthrough and inviting detailed studies on the catalytic mechanism and the assembly process. Studies on the assembly and maturation processes are of wide significance due to the fact that many human pathogens like Helicobacter pylori, Neisseria meningitides or Campylobacter jejuni use this type of Cox and it therefore might develop into an attractive drug-target. cbb3-Cox in R. capsulatus is encoded by the ccoNOQP gene operon which codes for four membrane proteins constituting cbb3-Cox. CcoP and CcoO are c-type cytochromes, containing periplasmic heme-binding motifs. CcoN is the central catalytic subunit which contains two b-type hemes and a copper ion. Investigating the delivery of Cu to the CcoN subunit and the assembly of all four subunits into the active cbb3-Cox complex were the main topics of this work. Here the role of the putative assembly factor CcoH, its structure and interaction with cbb3-Cox was investigated in detail. CcoH is a small membrane protein encoded in the ccoGHIS gene cluster located adjacent to the genes coding for cbb3-Cox. In vivo analysis of cbb3-Cox formation in a strain lacking ccoH showed the total absence of cbb3-Cox. Likewise, the stability of CcoH was drastically impaired in a ccoNOQP deletion strain. The mutual dependency of both proteins suggested their direct interaction, which was confirmed by site-directed photocrosslinking of CcoH to the CcoN subunit, by immunodetection of CcoH in cbb3-Cox complexes on Blue Native gels, by CcoH-cbb3-Cox co-purification and by in vitro labelling of cbb3-Cox complexes with radioactively labelled CcoH.[...]

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Projet I : Les endospores représentent un état de dormance des bactéries leur permettant de résister à des conditions extrêmes et de persister pendant des années. La formation d'endospores a façonné l'évolution puisqu’elle se produit exclusivement chez les Firmicutes. Plusieurs études ont rapporté la formation d'endospores chez des espèces en dehors des Firmicutes, en particulier chez deux espèces de Protéobactéries, Rhodobacter johrii et Serratia marscescens, et une espèce d'Actinobacteries, Mycobacterium marinum. Le fait d’identifier les endospores en dehors des Firmicutes pourrait affecter la forme de l'arbre de vie et aiderait dans notre lutte contre les agents pathogènes humains. Par conséquent, nous avons visé d’étudier l'endosporulation chez ces trois espèces en utilisant des approches avancées d'imagerie et d'analyse, y compris la microscopie corrélative alliant la microscopie optique et électronique (CLEM), la tomographie de cryo- électron (cryo-ET) et la lipidomique. Nous avons utilisé la bactérie sporulante bien caractérisée Bacillus subtilis comme contrôle positif de la sporulation. L'examen de R. johrii, S. marcescens et M. marinum en utilisant CLEM et cryo-ET a montré que les objets à phase brillante ne ressemblaient à aucun stade de l'endosporulation. Les cryo-tomogrammes ont montré que les objets à phase brillante chez S. marcescens étaient des débris cellulaires agrégés de cellules mortes, alors qu'ils présentaient des structures granulaires typiques des cellules bactériennes chez les R. johrii et M. marinum. L'analyse lipidomique chez R. johrii a identifié les structures granulaires comme des granules de stockage potentiels enrichis en triacylglycérides (TAG). Nous pensons que les TAG peuvent fournir une source d'énergie pour résister à l'épuisement des nutriments. Des approches biochimiques et bioinformatiques supplémentaires ont soutenu nos conclusions selon lesquelles R. johrii, S. marcescens et M. marinum sont des bactéries non sporulantes. Projet II : Les plasmides jouent un rôle vital dans la propagation des gènes de résistance au sein et entre les espèces bactériennes. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les systèmes bactériens impliqués dans le transfert et la maintenance des plasmides pour mieux aider dans notre lutte contre la propagation de la résistance aux antibiotiques. Dans cette thèse de doctorat, nous avons cherché à caractériser l'opéron alp7ARC, en utilisant l'homologue de l'actine bactérienne Alp7A pour séparer le plasmide pLS20 codant pour la résistance à la tétracycline dans B. subtilis. La stabilité du plasmide s'est avérée dépendante de l'opéron alp7ARC, indiquant un rôle essentiel dans la ségrégation plasmidique. Nos résultats préliminaires sur Alp7A ont montré qu'il s'assemble dans une nouvelle nanostructure tubulaire plutôt que des filaments, suggérant un nouveau mécanisme de ségrégation de l'ADN par Alp7A. Nous avons également étudié la structure d'Alp7A in vivo en utilisant une combinaison d'approches, notamment la biologie moléculaire, la Cryo-ET et la fLM. Nous avons également utilisé la CLEM pour localiser Alp7A dans des cellules entières à une résolution macromoléculaire. En outre, nous avons étudié la structure et la fonction d'Alp7A in vitro en transfectant B. subtilis et E. coli avec diverses constructions plasmidiques incorporant des mutations dans le gène d’Alp7A. Nous avons déployé différentes méthodes pour la purification de la protéine Alp7A, y compris la séparation par chromatographie, et le fractionnement au sulfate d'ammonium. J'ai discuté des divers défis que nous avons rencontrés dans ces expériences, tels que la contamination, l'instabilité de la protéine Alp7A et l'épaisseur bactérienne. Enfin, j'ai proposé des approches expérimentales alternatives qui aideraient à étudier le mécanisme de ségrégation des plasmides par Alp7ARC. / Project I: Endospores represent a dormant state of bacteria that allows them to withstand extreme conditions and persist for years. Endospore formation has shaped evolution, whereby it exclusively occurs in Firmicutes. Several studies have reported endospore formation in species outside of Firmicutes, particularly in two species of Proteobacteria, Rhodobacter johrii and Serratia marcescens, and one species of Actinobacteria, Mycobacterium marinum. Identifying endospores outside of Firmicutes would affect the shape of the tree of life and aid in our fight against human pathogens. Therefore, we aimed to investigate endosporulation in these three species using advanced imaging and analytical approaches, including correlative light and electron microscopy (CLEM), cryo-electron tomography (cryo-ET), and lipidomics. We used the well-characterized sporulating bacterium Bacillus subtilis as a positive control of sporulation. Examination of R. johrii, S. marcescens, and M. marinum using CLEM and cryo-ET showed that phase-bright objects did not resemble any stages of endosporulation. Cryo-tomograms revealed that the phase-bright objects in S. marcescens were aggregated cellular debris of dead cells, whereas they displayed granular structures typical of bacterial cells in R. johrii and M. marinum. Lipidomic analysis in R. johrii identified the granular structures as potential storage granules enriched with triacyl-glycerides (TAGs). We speculate that TAGs may provide an energy source to withstand the nutrient depletion. Additional biochemical and bioinformatics approaches supported our conclusions that R. johrii, S. marcescens, and M. marinum are non-sporulating bacteria. Project II: Plasmids play a vital role in the spread of resistance genes within and across bacterial species. Therefore, it is essential to understand the bacterial systems involved in the transfer and maintenance of plasmids to better aid in our fight against the spread of antibiotic resistance. In this doctorate, we aimed to characterize the alp7ARC operon, employing the bacterial actin homolog Alp7A to segregate the tetracycline resistance-encoding plasmid pLS20 in B. subtilis. The stability of the plasmid was shown to be dependent on the alp7ARC operon, indicating an essential role in plasmid segregation. Preliminary results on Alp7A showed that it assembles into a novel tubular nanostructure rather than filaments, suggesting a novel mechanism for DNA segregation by Alp7A. We further studied the structure of Alp7A in vivo using combination of approaches, including molecular biology, cryo-ET, and fLM. We also used CLEM to localize Alp7A in whole cells to a macromolecular resolution. Besides, we investigated the structure and function of Alp7A in vitro by transfecting E. coli with various plasmid constructs and purification by several methods, including affinity chromatography and ammonium sulfate precipitation. I discussed the diverse challenges we encountered in these experiments, such as bacterial thickness, contamination, and Alp7A protein instability. Finally, I proposed alternative experimental approaches for investigating the mechanism of plasmid segregation by Alp7ARC.