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L'ADN, support de l'information génétique, subit chaque jour de nombreuses attaques pouvant induire différents types de lésions. Que ce soit d'origine environnementale (agents chimiques), rayonnements ionisants) ou d'origine endogène (métabolisme de L'ADN, radicaux libres), chacun de ces agents peut provoquer des cassures simple ou double-brin dans la molécule d'ADN. Ces lésions doivent être détectées rapidement et réparées fidèlement, afin d'éviter d'engendrer une mutation pouvant déclencher une maladie telle le cancer, ou encore éviter de se transmettre à la descendance. Au cours de l'évolution, la cellule eucaryote a développé différentes voies spécifiques pour répondre à un stress génotoxique. Ainsi il existe un véritable réseau de surveillance et d'évaluation des dommages permettant à la cellule lésée de réparer l'ADN ou d'entrer en apoptose si les dommages sont trop importants. La poly(ADP-ribosyl)ation des protéines est une modification post-traductionnelle qui intervient rapidement dès qu'une cassure dans la molécule d'ADN est détectée. Le polymère est synthétisé à partir du NAD+ par une famille d'enzymes appelées PARP (poly(ADP-ribose)polymérase), dont le rôle principal est la maintien de l'intégrité du génome. Cette modification affecte les propriétés physico-chimiques ainsi que la fonction des protéines cibles. Celle-ci permet, entre autre, le recrutement des enzymes de réparation de l'ADN. Ce signal demeure toutefois transitoire, le polymère formé étant rapidement dégradé par la PARG (poly(ADP-ribose)glycohydrolase. Ce travail présente une analyse structurale de la PARP-3, un membre peu caractérisé de la famille PARP, ainsi qu'une analyse fonctionnelle de mutants de phosphorylation de la PARP-1 (premier article) qui montre que la phosphorylation du premier doigt de zinc de cette protéine altère son recrutement et sa persistance aux sites de cassure de l'ADN. Par ailleurs, de nombreuses évidences montrent que que la poly(ADP-ribosyl)ation des protéines peut survenir dans un contexte autre que les dommages à l'ADN, le second article présente les métabolismes qui peuvent être associés aux PARP-1 et 2 ainsi qu'à la PARG et monte un possible nouveau rôle biologique pour la PARP-1.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle qui est stimulée en réponse à des dommages à l'ADN. Les poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) synthétisent des polymères branchés de poly(ADP-ribose) (PAR) qui peuvent se lier de manière covalente et non-covalente à des protéines jouant ainsi un rôle dans des processus tels que la progression du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN, la stabilité de l'intégrité génomique et l'apoptose. Le cycle de dégradation du PAR induit aussi une variation des réserves en nucleotides comme le NAD+, l'ATP et l'AMP, influençant les voies énergétiques des cellules. Les techniques de « Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation » (MALDI) et de quantification de nucleotides par colorimétrie, fluorométrie et HPLC ont été utilisées pour déterminer de nouveaux partenaires protéiques interagissant avec le polymère d'ADPr, par l'entremise d'interaction directe, covalente et non-covalente, ou par l'entremise d'interaction indirecte, via le cycle de synthèse/dégradation du PAR qui induit d'importants changements métaboliques cellulaires.

Open reading frame (ORF) sso0433 from the archaeon Sulfolobus solfataricus encodes a protein kinase, SsoPK5 that exhibits 33% sequence identity to p53 related protein kinase (PRPK) from Homo sapiens and 26% sequence identity to piD261/Bud32 from Saccharomyces cerevisiae. Given this high degree of similarity, the objectives of this thesis were to (a) clone and purify recombinant SsoPK5, (b) examine its commonalities and differences with its eukaryotic homologues, and (c) determine if it was regulated by nucleotides or related compounds. Substantial progress was achieved on each objective. After successful cloning of ORF sso0433 and purification of its protein product, SsoPK5, it was determined that SsoPK5 was cold labile and incubation at 4ºC for an extended period of time rendered SsoPK5 incapable of phosphotransferase activity. When stored at room temperature, SsoPK5 was capable of transferring the γ-phosphate from ATP to casein, reduced carboxyamidomethylated and maleylated (RCM) lysozyme,and p53. SsoPK5 phosphotransferase activity required a divalent metal cofactor; like pid261/Bud32, SsoPK5 preferred Mn²⁺ over the more commonly preferred Mg²⁺. SsoPK5 was shown to phosphorylate itself on threonine and serine residues; one of the specific amino acid residues modified is threonine-151. Recombinant SsoPK5 is activated by ADP-ribose and 5′-AMP. Activation was observed when SsoPK5 was stabilized by ATP or a nonhydrolytic analogue, such as β,γ- methylene adenosine 5′-triphosphate (AMP-PCP). Activation was not a result of phosphoryl transfer nor hydrolytic breakdown of ATP or 5′-AMP. This was deduced by the lack of ³²P radioactivity incorporated into SsoPK5 during pre-incubation with [γ-³²P] ATP for 60 min at 65ºC, and activation by adenosine 5′-O-thiomonophosphate (AMPS), a hydrolysis-resistant analog of AMP. These results may indicate that ADP-ribose acts as a pseudochaperone for SsoPK5 thereby facilitating maximal activity. / Ph. D.

L'intégrité de l'ADN génomique humain est maintenue par des systèmes de réparation de l'ADN qui protègent les cellules des dommages causés par des agents environnementaux ou des lésions spontanées de l'ADN. Chaque cellule peut subir jusqu'à 10⁵ lésions par jour, y compris les cassures double-brin de l'ADN (CDB). La poly(ADPribosyl)ation (PARylation) est l'un des premiers événements de signalisation moléculaire survenant aux CDBs. Il est catalysé par les poly(ADP-ribose)polymérases (PARP) qui sont directement activées par ces lésions d'ADN. Le fait de ne pas générer de poly(ADP)ribosyl (pADPr) en réponse à des dommages à l'ADN par une inhibition chimique ou par l'absence de PARP-1 augmente la sensibilité cellulaire au stress génotoxique, indiquant que la pADPr elle-même est une molécule clé de signalisation des dommages à l'ADN. L'inhibition de l'enzyme de signalisation des dommages à l'ADN, la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) est l'une des nouvelles thérapies les plus prometteuses contre le cancer. Les inhibiteurs de PARP sensibilisent les cellules cancéreuses aux agents endommageant l'ADN et tuent efficacement les cellules cancéreuses du sein, des ovaires et du pancréas déficientes en BRCA1 (Breast Cancer gene 1) et BRCA2 (Breast Cancer gene 2), ce qui suggère que les cellules déficientes en réparation des CDBs sont extrêmement sensibles à l'inhibition de PARP. Pourtant, les mécanismes sous-jacents à cette létalité synthétique entre le déficit de réparation du CDB et l'inhibition de PARP restent mal définis. Il y a un débat considérable sur le mécanisme par lequel l'inhibition de PARP tue les cellules déficientes en réparation de l'ADN, et le plein potentiel des inhibiteurs de PARP dans le traitement du cancer ne peut être obtenu que par une compréhension claire des voies de réponse aux dommages de l'ADN (DDR) aux CDB et comment ils sont affectés par les inhibiteurs de PARP. L'objectif général de ma thèse est d'étudier le rôle de PARP-1 dans la réparation DSB et d'identifier les interacteurs de PARP-1 qui jouent également un rôle dans ce processus. Les cellules eucaryotes réparent les CDBs par deux voies principales, la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). La HR est initiée par la liaison des CDBs par BRCA1 et le complexe MRE11-RAD50-NBS1 et des nucléases EXO1/DNA2 pour générer de l'ADN simple-brin, qui est ensuite utilisé par la recombinase RAD51 et le complexe BRCA1-PALB2-BRCA2. Une question clé dans notre domaine concerne les facteurs critiques pour réguler le choix de la voie CDB. HR est initiée à partir d'extrémités DSB hautement résectées, tandis que dans le NHEJ, la résection est empêchée par des facteurs de réparation clés incluant RIF1 et 53BP1. En utilisant des cellules déficientes en PARP-1, nous avons observé que deux inhibiteurs de la résection de l'ADN et des régulateurs de choix de voie, RIF1 et 53BP1, la formation de foyers induits par des dommages à l'ADN sont fortement altérés. Cela confirme notre hypothèse selon laquelle PARP-1 participe à la réparation du DSB en influençant la résection de l'ADN. Afin de mieux comprendre le mécanisme de résection et le rôle que PARP-1 y joue, nous avons identifié d'autres protéines qui interagissent avec PARP-1 et modulent ce processus. Pour ce faire, nous avons utilisé des données sur les protéines de liaison au pADPr générées à la fois dans notre laboratoire et celui de notre collaborateur Ted Dawson de Johns Hopkins. Les candidats sélectionnés à partir de ces listes ont été criblés pour identifier une seule cible qui démontrerait un phénotype similaire à la perte de PARP-1. Deux cibles initiales ont été explorées et finalement une seule protéine à doigt de zinc a été choisie comme cible principale. Nous devons relever la fonction de ce doigt de zinc en HR, dans l'espoir qu'il permettra de découvrir davantage les mécanismes de PARP-1 en résection. En résumé, cette thèse élucide le rôle de PARP-1 dans la résection de l'ADN et identifie une protéine à doigt de zinc non étudiée auparavant qui interagit avec PARP-1 et partage une fonction similaire à PARP-1 dans la résection de l'ADN. / The integrity of human genomic DNA is maintained by DNA repair systems that will protect cells from damage by environmental agents or spontaneous DNA lesions. Each cell can experience up to 10⁵ lesions daily, including DNA double-strand breaks (DSB)s. Poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) is one of the earliest molecular signalling events occurring at DNA DSBs. It is catalysed by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) that are directly activated by those DNA lesions. Failure to generate pADPr in response to DNA damage by either chemical inhibition or absence of PARP-1 increases the cellular sensitivity to genotoxic stress, indicating that pADPr itself is a key DNA damage signalling molecule. Inhibition of the DNA damage signalling enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is among the most promising new therapies in cancer. PARP inhibitors sensitize cancer cells to DNA damaging agents and efficiently kill BRCA1- and BRCA2-deficient breast, ovarian and pancreatic cancer cells, suggesting that cells deficient in DSB repair are exquisitely sensitive to PARP inhibition. Yet, the mechanisms underlying this synthetic lethality between DSB repair deficiency and PARP inhibition remain poorly defined. There is considerable debate about the mechanism through which PARP inhibition kills DNA repair-deficient cells, and the full benefit of PARP inhibitors in cancer therapy can only be achieved by a clear understanding of the DNA damage response (DDR) pathways to DSBs and how these are affected by PARP inhibitors. The overall aim of my PhD is to investigate the role of PARP-1 in DSB repair and identify interactors of PARP-1 which also play a role in this process. Eukaryotic cells repair DSBs by two major pathways, non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). HR is initiated by the binding of DSB by BRCA1 and the end resection of the DSB by MRE11 (and the associated NBS1, RAD50, CtIP, and EXO1) to generate single-stranded DNA, which is further processed by RAD51 and BRCA1-PALB2-BRCA2. A key question in our field regards which factors are critical for regulating the DSB pathway choice. HR is initiated from highly resected DSB ends, whereas in NHEJ, resection is prevented by key repair factors that include RIF1 and 53BP1. Using PARP-1-deficient cells, we have observed that two inhibitors of DNA resection and regulators of pathway choice, RIF1 and 53BP1, are strongly impaired in forming DNA damage-induced foci. This supports our hypothesis that PARP-1 participates in DSB repair by influencing DNA resection. In order to further understand the mechanism of resection and the role that PARP-1 plays in it we also aim to identify other proteins which interact with PARP-1 and modulate this process. To accomplish this, we made use of data on PAR binding proteins generated both in our lab and that of our collaborator Ted Dawson. The candidates selected from these lists were screened to identify a single target that would demonstrate a similar phenotype to PARP-1 loss. Two initial targets were further explored and finally a single zinc finger protein was selected as our primary target. We aim to characterize the function of this zinc finger in HR, in the hopes that it will further uncover the mechanisms of PARP-1 in resection. In summary this thesis elucidates the role of PARP-1 in DNA resection and identifies a previously unstudied zinc finger protein which interacts with PARP-1 and shares a similar function to PARP-1 in DNA resection.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 106-126. Publié aussi en version électronique.

ADP-ribose polymer metabolism has been studied in human cells derived from a patient with Glutamyl Ribose Phosphate Storage Disease (GRPSD) and in mouse C3H1OT1/2 cells following oxidative stress induced by hydrogen peroxide (H202 ). It has been postulated that GRPSD resulted from an abnormality in ADP-ribose polymer metabolism. This study has shown that these cells exhibit reduced poly(ADP ribose) polymerase activity which is proposed to result from modification of the enzyme with ribose phosphate groups. The modification in the polymerase is proposed to be secondary to a defect in either ADP-ribosyl proteinlyase or an overproduction of a cellular phosphodiesterase. The metabolism of ADP-ribose polymers was rapidly altered by H202 and there were independent effects on adenine nucleotide pools. The results suggest that ADP-ribose polymer metabolism is involved in cellular defenses to oxidative stress.

Modification of proteins by ADP-ribose has been shown to be a versatile modification with respect to the amino acid side chain. The results described here will allow the study of the biological importance of ADP-ribose glycation and also allow differentiation on crude extracts between enzymatic modifications from protein ADP-ribose glycation that can occur due to the presence of NAD glycohydrolases.