Universiẗat, Diss.--Göttingen, 2007.

Universiẗat, Diss.--Münster, 1996.

Thesis (doctoral)--Freie Universität Berlin, 1982.

Zugl.: Göttingen, Univ., Diss., 2006

Univ., Diss.--Münster, 1995.

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

Universiẗat, Diss.--Göttingen, 2006.

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Hemmung des induzierten Abbaus von Matrixproteinen sowie von Gelatine durch Matrixmetalloproteinasen mithilfe des Kiefernrindenextraktes Pycnogenol, einer Auswahl seiner Inhaltsstoffe und seiner Metabolite d-(3,4-Dihydroxyphenyl)-g-valerolacton (M1) und d-(3-Methoxy-4-hydroxyphenyl)-g-valerolacton (M2) untersucht. Beide Metabolite zeigten eine signifikante Hemmwirkung und lagen in der Effektivität ihrer Hemmung auf einer µg/ml-Basis immer leicht über der des Gesamtextraktes. Um die in Frage kommenden Mechanismen der Hemmwirkung gegenüber Matrixmetalloproteinasen aufzuklären, wurde die Bindung des Gesamtextraktes an Hautpulver, sowie an die Matrixproteine Collagen und Elastin untersucht. Es wurde ein Schutz der Substrate vor enzymatischer Degradierung durch MMPs infolge einer Adsorption der Procyanidine abgeleitet. Die Metabolite M1 und M2 schienen auf Grund eines anderen Mechanismus die Aktivität der MMPs zu hemmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmwirkung der untersuchten Inhibitoren auf MMP-9 nach Zinkzusatz vollständig aufgehoben wurde. Daher konnte eine direkte Interaktion von beiden Metaboliten auf das Zinkatom des aktiven Zentrums angenommen werden. Die Wirkungen der Metabolite M1 und M2 wurden anschließend auf zellulärer Ebene untersucht. Es wurde getestet, ob sie einen Einfluss auf die Sekretion von MMP-9 aus bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Monocyten hatten. Als Positivkontrolle wurden antiinflammatorisch wirkenden PPAR-Agonisten, sowie das endogene Glucocorticoid Hydrocortison eingesetzt, deren Hemmwirkung auf die MMP-9-Freisetzung gut belegt war. Die PPAR-Agonisten waren in Bezug auf die MMP-9-Sekretion die wirksamsten Inhibitoren. Mit einer bemerkenswert niedrigen IC50 waren die beiden Metabolite M1 und M2 in ihrer Wirkung equipotent. Im Vergleich zu Hydrocortison konnte sogar gezeigt werden, dass beide Metabolite potentere Inhibitoren darstellten als das körpereigene antiinflammatorisch wirksame Glucocorticoid. In pharmakokinetischen Untersuchungen wurden Plasmaproben von Probanden nach Einmal- (n = 11) und Mehrfach- (n = 5) Einnahme von 300 bzw. 200 mg Pycnogenol mithilfe der HPLC vermessen. Durch diese Untersuchungen sollte festgestellt werden, ob eine Absorption von Extraktbestandteilen, sowie Metabolisierungsreaktionen im Körper stattfinden. Es konnten in den Proben der meisten Probanden erstmalig im Plasma sowohl Extraktbestandteile als auch der Metabolit M1 nachgewiesen werden. Daneben konnten zehn bislang unbekannte Substanzen detektiert werden, die in weiterführenden Arbeiten noch identifiziert werden müssen. Es wurde eine große interindividuelle Variabilität sowohl im Grad der Konjugation als auch bei den im Plasma vorliegenden Konzentrationen der einzelnen Substanzen festgestellt. Nach Einmalgabe des Extraktes wurden verschiedene Gruppen von Substanzen mit frühen, mittleren, späten und interindividuell sehr variablen Plasmaspiegelmaxima nachgewiesen. Es konnten erstmalig nach Pycnogenol-Einnahme pharmakokinetische Parameter der bekannten und im Gesamtextrakt quantifizierbaren Verbindungen errechnet werden. Nachfolgend wurde in den Plasmaproben der Probanden nach Pycnogenol-Einnahme nachgewiesen, dass Wirksubstanzen in Konzentrationen vorhanden waren, die tatsächlich pharmakodynamische Effekte erzielen konnten. Dazu wurde ein neues Versuchskonzept erstellt, bei dem die Hemmung der MMP-9-Sekretion auf zellulärer Ebene mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer vor und nach Pycnogenol-Einnahme ex vivo untersucht wurde. Nach Mehrfachgabe bewirkten die verdünnten Plasmaproben der Probanden eine signifikant verminderte MMP-9-Sekretion um im Mittel 25 %. Plasmaproben nach einmaliger Einnahme von 300 mg Pycnogenol riefen schon 30 Minuten nach Extrakt-Einnahme eine Hemmung der MMP-9-Sekretion hervor. Diese Hemmung war bis 14 Stunden nach der Einnahme nachzuweisen. Einen wichtigen Transkriptionsfaktor im Entzündungsgeschehen stellt NF-kB dar. Stimuliert durch verschiedene Agenzien führt NF-kB u.a. zur Induktion von MMP-9. Nach Mehrfachgabe konnte in ex vivo Versuchen mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer nach Inkubation mit stimulierten Monocyten eine etwa 15 %ige Hemmung der NF-kB-Aktivierung gezeigt werden. Es konnte am Beispiel von MMP-9 und NF-kB erstmalig gezeigt werden, dass nach Einnahme von Pycnogenol auch in vivo Konzentrationen an Metaboliten bzw. Bestandteilen erreicht werden, die ex vivo in der Lage waren, pharmakodynamische Effekte zu erzielen. Bislang konnte jedoch keine Zuordnung der pharmakokinetisch identifizierten Verbindungen zu den pharmakodynamischen Effekten erfolgen. Die umfassenden in vitro, ex vivo und in vivo Untersuchungen von Bestandteilen und/oder Metaboliten des Pycnogenol-Extraktes in der vorliegenden Arbeit leisten auf molekularer und auf zellulärer Ebene einen grundlegenden Beitrag zum Verständnis der klinischen antiinflammatorischen Effekte des Kiefernrindenextraktes. / In the present thesis, the inhibition of matrixmetalloproteinase (MMP)-induced degradation of matrix proteins and of gelatin was investigated. For the first time, a standardized extract of French maritime pine bark, a selection of its components and two metabolites d-(3,4-dihydroxyphenyl)-g-valerolacton (M1) and d-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-g-valerolacton (M2) were tested as inhibitors for MMP-1, MMP-2 and MMP-9. Both metabolites displayed a significant inhibition of all MMPs and were more potent on a µg/ml basis compared to the extract. In order to elucidate the mechanism of inhibition, the binding of the extract to skin powder as well as to the matrix proteins collagen and elastin was investigated. A protection of the substrates from MMP-induced degradation via an adsorption of procyanidins was assumed. The metabolites M1 and M2 obviously inhibited the activity of MMPs by a different mechanism. It was shown that the inhibition caused by the investigated compounds was completely abrogated after addition of zinc. Therefore, a direct interaction of both metabolites with the catalytic zinc atom was deduced. The effects of M1 and M2 were subsequently investigated on a cellular level. It was analyzed whether the metabolites influenced the secretion of MMP-9 from bacterial lipopolysaccarid (LPS)-stimulated monocytes. As positive controls antiinflammtory PPAR agonists, as well as the endogenous glucocorticoid hydrocortisone were utilized as their inhibition of the MMP-9-secretion was well documented. With respect to the MMP-9 secretion, the PPAR agonists were the most effective inhibitors. Both metabolites were equipotent in their effects, with a remarkably low IC50. In comparison to hydrocortisone, both metabolites were even more potent than the endogenous glucocorticoid with its antiinflammatory properties. In pharmacokinetic investigations plasma samples from volunteers after a single (n = 11) and repeated (n = 5) intake of 300 mg, respectively 200 mg Pycnogenol were analyzed by HPLC. The aim of these measurements was to find out whether absorption of ingredients and metabolism take place in the human body. For the first time, ingredients of the extract, as well as the metabolite M1 were determined in plasma samples of most of the volunteers after singular or repeated Pycnogenol intake. Furthermore, ten so far unidentified compounds were detected. A large interindividual variability in the concentrations detected as well as in the degree of conjugation with glucuronic acid and sulphate of all substances was observed. After a single intake of the extract, compounds with early, intermediate and late maximum plasma levels and substances which showed highly interindividually variable plasma levels were classified. For the first time pharmacokinetic parameters of the known extract components were calculated. Subsequently it was demonstrated that the concentration of effective compounds in plasma samples of volunteers after Pycnogenol intake was sufficiently high to evoke pharmacological effects. A new concept was developed for this investigation. Inhibition of the secretion of MMP-9 on a cellular level was performed ex vivo with plasma samples before and after Pycnogenol intake. After repeated intake, diluted plasma samples of the volunteers evoked a significant decrease in MMP-9 secretion of about 25 %. Plasma samples after a single intake of 300 mg Pycnogenol caused an inhibition of the MMP-9 secretion already after 30 minutes. The inhibition persisted up to 14 hours. An important transcription factor in inflammatory processes is NF-kB. Activated by various stimuli, NF-kB mediates the induction of MMP-9. In ex vivo experiments, plasma samples of volunteers after repeated Pycnogenol intake were incubated with stimulated monocytes. An inhibition of the NF-kB activation of 15 % was observed. The percentage of inhibition of NF-kB activation correlated with inhibition of MMP-9 secretion for matched plasma samples. These results suggested that inhibition of MMP-9 secretion by Pycnogenol ex vivo was mediated via NF-kB pathway. The examples of MMP-9 and NF-kB inhibition showed for the first time that sufficiently high concentrations of ingredients and/or metabolites of Pycnogenol were reached in vivo that exhibited pharmacodynamically relevant effects ex vivo. So far, no correlation was found between the pharmacokinetically identified substances and the pharmacodynamic effects. The comprehensive in vitro, ex vivo and in vivo investigations of ingredients and/or metabolites of Pycnogenol, on a molecular as well as on a cellular level, contribute substantially to the understanding of the clinical antiinflammatory effects of pine bark extract.

Um die Grundlagen für die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellulären Ebene aufzuklären, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entzündlichen Vorgängen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gefäß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Gedächtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgeführten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabhängige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entzündungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enthält, und Hydrocortison zeigte M1 zusätzlich einen stärkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entzündungsreiz. Die Zytotoxizität von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalfängereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabhängiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine mögliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, primären Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise für eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranständige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ansätze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren über die Testzeiträume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl über kurze (≤ 45 min) als auch über längere Zeiträume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivität der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabhängige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazelluläre NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in jüngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universitätsklinikum Zürich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 wöchiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gefäßerweiterungskapazität (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 führte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur möglichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgewählten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich höheren Verteilung ins Gehirn für die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechusäure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankengängig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den höchsten logBB-Wert und somit die höchste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu überwinden. Im Kontext einer möglichen Anwendung bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen wurde zusätzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem primären Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entzündungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverdünnungen deutliche konzentrationsabhängige Hemmeffekte um bis zu ~50 % der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beiträge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verständnis der möglichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden. / Many clinical trials with the administration of a standardized maritime pine bark extract (Pycnogenol®) have shown benefical effects. In order to study the basic mechanistic principles of how the extract might work on a cellular level the impact of the extract components and especially of the metabolite M1 (chemically named δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone or 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) one) on nitric oxide (NO) producing systems was tested and evaluated. NO is involved in many physiological and pathophysiological processes in living organisms. There are three different isoforms of NO-synthases (NOS) known in humans so far: the inducible NOS (iNOS) is pathologically associated with inflammatory processes, the endothelial NOS (eNOS) is linked to (cardio-)vascular diseases, and the neuronal NOS (nNOS) plays a role in memory formation, but is also put in context to neuronal cytotoxicity within the course of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. The metabolite M1 is generated by microbiota in the human colon after per os ingestion of the pine bark extract and thereafter enters the circulation. M1 showed a strong concentration dependent inhibition of NO-release by iNOS from murine macrophages after an inflammatory stimulus (IC50= 1.28 µg/mL). M1 was even more potent at inhibiting NO-release from macrophages than fraction I of the pine bark extract, which predominantly contains monomeric extract compounds, and slightly more potent than hydrocortisone. Cytotoxicity of M1 was found to be modest in the test system. In addition to the NO-radical scavenging activities of M1 there were also profound concentration dependent inhibitory effects on iNOS protein expression (IC50= 3.78 µg/mL). As there is a gap between determined plasma concentrations of M1 after pine bark extract ingestion and required bioactive concentrations in cell culture test systems the binding of M1 to human endothelial cells, human monocytes and murine macrophages in the presence of serum proteins was determined in order to test for cellular M1 accumulation. There was a strong binding of M1 to these cells and a possible facilitated uptake via distinct membrane transporters was shown with using an influx-inhibitor (phloretin). In order to analyze the very small amounts of NO produced by eNOS new methodic approaches were established. Formerly unkown pitfalls and limitations with using the fluorescence dye DAF-2 (4,5-diaminofluorescein) and with applying different detection systems for NO were revealed. DAF-2 was subject to conversion to the NO adduct triazolofluorescein (DAF-2T) even without an externally added NO source under certain assay and storage conditions, especially after freezing and thawing sample solutions. Thus control of spontaneous reagent conversion is advisable. The monomers (+)-catechin, (-)-epicatechin, resveratrol, and M1 were not stable over time and displayed highly dynamic auto-fluorescence. In accordance with their radical scavenging activity the polyphenols seemingly showed a concentration dependent inhibitory effect on NO-release from endothelial cells over short (≤ 45 min) and longer incubation periods (14-20 h). After incubation with the monomers eNOS-protein expression was not markedly affected. When applying very high concentrations of fraction I of the extract an increase of cellular eNOS protein content was observed, but cytotoxic artefacts could not be ruled out though. Recently, competitive endogenous in vivo inhibitors of NOS were identified as methylated arginines (ADMA= asymmetric-, SDMA= symmetric dimethylarginine). In the course of a randomized, double-blind, placebo-controlled and cross-over designed clinical trial, which was conducted at the University of Zurich and enrolled 28 coronary heart disease patients, plasma concentrations of methylated arginines before and after the 8-week intake of pine bark extract were determined. Despite of improvements in flow-mediated dilation parameters and decrease of 15-F2t-Isoprostane plasma concentrations there was no significant alteration of plasma concentrations of ADMA, SDMA and ET-1 (endothelin-1) after the pine bark extrakt intake. The nNOS is found in neuronal cells but is also expressed in other cell types like muscle cells. In a rhabdomyosarcoma (A-673) cell culture model the metabolite M1 had no meaningful effect on nNOS expression. In order to contribute answering the question whether polyphenols are likely to cross the blood brain barrier an in silico model for predicting polyphenol distribution between blood and brain tissue (logBB) was developed. logBB values for selected polyphenols were calculated and resulted in the following rank order with increasing probability of an uptake into the brain: protocatechuic acid< quercetin < cyanidin < (+) catechin < (-)-epicatechin < phloretin < M1. The metabolite M1 showed the highest logBB value of the tested polyphenols and thus had the highest predicted feasibility for crossing the blood brain barrier as described with the newly established computer based model. The extract of the fruits from Morinda citrifolia L. is traditionally utilized for the treatment of inflammatory diseases. Applying a primary human monocyte cell culture model the extract was tested for its ability to inhibit the secretion of matrix-metalloprotease-9 after an inflammatory stimulus. Dilutions of the extract in cell culture media showed profound concentration dependent inhibitory effects with up to a ~50 % decrease of metalloprotease secretion that were comparable to hydrocortisone. Thus, new and substantial contributions were made in this work allowing a better understanding of the mode of action of the tested plant extracts, especially of the effects of polyphenols on physiological relevant nitric oxide systems, and gaining a deeper methodical knowledge in the challenging field of NO-analysis.

Zugl.: Göttingen, Univ., Diss., 2007