The former military air-base Hradcany is among the most contaminated with organic pollutants localities in Czech Republic. Main cleanup strategy in the area is the bioremediation taking advantage on the natural potential of the autochthonous soil microorganisms to evolve catabolic pathways for in situ degradation of the pollutant. The diversity and abundance of the pathways, as well as the specificity and activity of the encoded enzymes are priority biotic factors determining the bioremediation efficiency. Main task of this work was to analyze the bacterial diversity in jet fuel contaminated soils based on key catabolic genes encoding the Rieske non-haem iron dioxygenases of the toluene/ biphenyl oxygenase branch. High molecular soil DNA was extracted and the sequences encoding catabolic genes were selectively enriched by hybridization to biotinylated oligonucleotides on magnetic microbeads with covalently bound streptavidin. Fragments of the genes for the -subunits of Rieske non-haem iron oxygenases were amplified and analyzed by restriction analysis, cloning and sequencing. Their evolutionary histories were inferred using the Neighbour-Joining and the maximum likelihood methods. The catabolic genes diversity in the actively bioremediated and highly polluted soil HRB was compared with the diversity in the...

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des composés ubiquitaires issus de la combustion incomplète de matières organiques. Ils sont à l'origine de pollutions de l'environnement, surtout liées à l'exploitation des produits pétroliers, car ce sont des composés toxiques pour les êtres vivants et pour l'homme en particulier. De nombreuses bactéries capables de dégrader les HAP ont été isolées et étudiées, mais celles qui les dégradent in situ sont mal connues, car moins de 5% des bactéries du sol sont cultivables en laboratoire. Le premier objectif de cette étude était d'identifier les bactéries qui dégradent les HAP dans le sol par des méthodes moléculaires indépendantes de la culture. A cette fin, une stratégie de marquage isotopique in situ a été mise en œuvre qui repose sur l'utilisation du phénanthrène, un HAP à trois cycles, dans lequel l'isotope naturel du carbone a été remplacé par le 13C. Cette molécule a été introduite comme traceur dans des microcosmes contenant du sol provenant d'un bassin de rétention des eaux de ruissellement d'autoroute. Les bactéries ayant incorporé le 13C ont ensuite été identifiées par séquençage des gènes d'ARNr 16S amplifiés à partir de l'ADN marqué extrait du sol. Les résultats montrent que des Betaprotéobactéries peu étudiées à ce jour, appartenant aux genres Acidovorax, Rhodoferax, Hydrogenophaga et Thiobacillus, ainsi que des Rhodocyclaceae, étaient les principaux acteurs de la dégradation du phénanthrène. La prépondérance des Betaprotéobactéries a été établie par des mesures de PCR quantitative. Une analyse dynamique de la diversité bactérienne a montré que celle-ci changeait en fonction de la biodisponibilité du phénanthrène. En outre, la diversité d'arène-dioxygénases impliquées dans la dégradation des HAP a été explorée sur le plan phylogénétique et fonctionnel. Nous avons ainsi détecté des séquences nouvelles, pour la plupart apparentées à des dioxygénases de Sphingomonadales et de Burkholderiales. Grâce à la construction et l'expression d'enzymes hybrides, il a été possible, pour la première fois, d'associer une activité catalytique d'oxydation des HAP à des séquences partielles de gènes, amplifiées à partir de l'ADN du sol. Les résultats obtenus et les outils mis au point dans cette étude pourront servir à développer des méthodes de diagnostic et de suivi de biodégradation de polluants, par exemple dans le cadre d'opérations de bioremédiation de sites pollués par les HAP. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous compounds produced by incomplete combustion of organic matter. They are a source of environmental pollution, especially associated to oil product exploitation, and represent a threat for living organisms including human beings because of their toxicity. Many bacteria capable of degrading PAHs have been isolated and studied. However, since less than 5% of soil bacteria can be cultivated in the laboratory, bacterial species able to degrade PAHs in situ have been poorly studied. The first goal of this study was to identify bacteria that degrade PAHs in soil using culture-independent molecular methods. To this end, a strategy known a stable isotope probing has been implemented based on the use of phenanthrene, a three rings PAH, in which the natural isotope of carbon was replaced by 13C. This molecule has been introduced as a tracer in microcosms containing soil from a constructed wetlands collecting contaminated water from highway runoff. Bacteria having incorporated the 13C were then identified by 16S rRNA gene sequence analysis after PCR amplification from labeled genomic DNA extracted from soil. The results show that so far little studied Betaproteobacteria, belonging to the genera Acidovorax, Rhodoferax, Hydrogenophaga and Thiobacillus, as well as Rhodocyclaceae, were the key players in phenanthrene degradation. Predominance of Betaprotéobactéries was established thanks to quantitative PCR measurements. A dynamic analysis of bacterial diversity also showed that the community structure of degraders depended on phenanthrene bioavailability. In addition, the phylogenetic diversity of ring-hydroxylating dioxygenases, enzymes involved in the first step of PAH degradation, has been explored. We detected new sequences, mostly related to dioxygenases from Sphingomonadales and Burkholderiales. For the first time, we were able to associate a catalytic activity for oxidation of PAHs to partial gene sequences amplified from soil DNA, by constructing hybrid enzymes and assaying their activity The results obtained and the tools implemented in this study may be used to develop methods for the diagnostic and monitoring of pollutant biodegradation in processes such as bioremediation of PAHs contaminated sites.