Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Banca: Eliana Morielle Versute / Banca: Humberto Tonhati / Resumo: Nesse trabalho apresentamos o primeiro mapa comparativo do cromossomo 6 do búfalo de rio (BBU6), desenvolvido a partir da utilização de um painel de células somáticas híbridas irradiadas búfalo-roedor com fragmentação de 5000 rads. O mapa preliminar construído é composto por 33 marcadores, os quais estão ordenados em dois grupos de ligação compostos por 12 microssatélites, 19 genes codificantes e duas ESTs. A freqüência de retenção observada entre os marcadores variou de 14.4% a 40%. A ordem dos marcadores dentro dos grupos de ligação do BBU6, em sua maioria, é consistente com o mapa RH bovino. Esse mapa preliminar do BBU6 é um ponto de partida para comparar a ordem dos genes entre as espécies, fornecendo uma oportunidade para estudar micro-arranjos nesse cromossomo, além de possibilitar a clonagem posicional em búfalo de rio. / Abstract: We present the first radiation hybrid map of BBU6 developed from a recently constructed river buffalo whole-genome radiation hybrid panel (BBURH5000). The preliminary map contains 33 cattle-derived markers, including 12 microsatellites, 19 coding genes and two ESTs, distributed in two linkage groups. The retention frequency of individual markers ranged from 14.4% to 40.0%. Most of the marker order within the linkage groups is consistent with the cattle RH maps. This preliminary BBU6 RH map is the starting point for comparing gene order between both species, presenting opportunity for examination of micro-rearrangements of these chromosomes and, thereby enhancing the possibility of positional candidate cloning in river buffalo. / Mestre

Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Banca: Herminone Elly Melara de Campos Bicudo / Banca: Luciana Correia de Almeida Regitano / Banca: Eliana Morielle Versute / Banca: Artur Luiza da Costa da Silva / Resumo: O cromossomo 1 do genoma bubalino (BBU1), o maior cromossomo do cariótipo do búfalo de rio, é um cromossomo submetacêntrico que possui homologia com os cromossomos 1 e 27 do genoma bovino. Neste trabalho, apresentamos o primeiro mapa RH para este cromossomo, construído por meio da utilização de um painel de células somáticas híbridas irradiadas búfalo-roedor, denominado BBURH5000. O mapa consistiu em 69 marcadores derivados dos cromossomos bovinos BTA1 e BTA27, incluindo 48 genes codificantes, 17 microssatélites e quatro ESTs distribuídos em dois grupos de ligação. A freqüência de retenção observada entre os marcadores variou de 17.8% a 52.2%. A ordem dos marcadores dentro dos grupos de ligação foi, em sua maioria, idêntica a ordem encontrada nos mapas RH e de seqüência do genoma bovino. A análise comparativa do mapa RH obtido para BBU1 com o genoma humano revelou oito blocos homólogos de sintenia entre BBU1 e segmentos correspondentes dos cromossomos humanos 3, 4, 8 e 21, sendo a maioria deles rearranjados quanto à ordem dos genes e orientação dos blocos. Os blocos de sintenia também foram comparados com os genomas de outras espécies de mamíferos, como boi, chimpanzé, cachorro e cavalo. Considerando a inexistência de mapas de ligação para o búfalo de rio, o mapa RH obtido neste estudo fornece dados essenciais para os estudos comparativos deste cromossomo com qualquer outra espécie de mamífero. / Abstract: The largest chromosome in the river buffalo karyotype, BBU1, is a submetacentric chromosome with reported homology between BBU1q and bovine chromosome 1 and between BBU1p and BTA27. We present the first radiation hybrid map of this chromosome containing 69 cattle derived markers including 48 coding genes, 17 microsatellites and four ESTs distributed in two linkage groups. The RH map was constructed based on the analysis of a recently developed river buffalo-hamster whole genome radiation hybrid panel (BBURH5000). The retention frequency of individual markers across the panel ranged from 17.8% to 52.2%. With few exceptions, the order of markers within linkage groups is identical to the order established for corresponding cattle sequence and RH maps. Comparative analysis between BBU1-RH5000 and the human genome revealed eight homologous synteny blocks corresponding to HSA3q, HSA4q, HSA8p and HSA21q. Most of the blocks showed rearrangements in the gene order and in the orientation of the synteny blocks. The synteny blocks were also compared with other mammalian genomes, such as bovine, chimpanzee, dog and horse. Considering that a genetic linkage map does not exist for river buffalo, the radiation hybrid map generated in this study provides valuable data for comparative mapping of BBU1 chromosome. / Doutor

Resumo: O cromossomo X apresenta conteúdo conservado entre as diferentes espécies de mamíferos. No de búfalo de rio (Bubalus bubalis), espécie que vem ganhando interesse econômico no Brasil e no mundo, sua morfologia é acrocêntrica. No presente trabalho, apresentamos o primeiro mapa RH do cromossomo X bubalino gerado a partir do recentemente construído painel de células híbridas irradiadas búfalo-roedor (BBURH5000). Este mapa contém um total de 33 marcadores derivados de bovino, incluindo dez genes, quatro ESTs e 19 microssatélites. Estes marcadores estão distribuídos em dois grupos de ligação: LG1 com oito marcadores e abrangendo 125.6 cR, e o LG2 com 25 marcadores abrangendo 366.3 cR. As freqüências de retenção (FR) dos marcadores variaram de 7,8% para o gene UREB1 a 28,9% para os microssatélites MAF45 e INRA30. O BBUXRH5000 foi comparado ao mapa de seqüência e mapa RH3000 do cromossomo X bovino evidenciando alguns poucos rearranjos entre as duas espécies, e alguns prováveis erros de mapeamento em uma das duas espécies quando comparado com BTAX build 3.1 bovino. A utilização de primers derivados de boi para mapeamento em búfalo foi realizada com êxito, e a distribuição dos marcadores ao longo do X considerada satisfatória, culminando em uma cobertura adequada para os primeiros esforços de mapeamento deste cromossomo. Análises comparativas do BBUX com o cromossomo X de outras espécies de mamíferos (humano, camundongo, ovelha, cavalo e cachorro) foram realizadas, revelando grande conservação de sintenia deste cromossomo na classe mamífera e, extensa conservação da ordem gênica entre búfalo e ovelha e búfalo e boi. O BBUXRH5000 aqui apresentado é um ponto de partida para a construção de mapas de alta resolução, necessários para caracterização de rearranjos que ocorreram durante a evolução e futuros estudos com o objetivo de dissecar características genéticas de interesse econômico. / Abstract: The X chromosome shows conserved content among different mammalian species. In river buffalo (Bubalus bubalis), a brazilian and worldwide economic important specie, the X chromosome morphology is acrocentric. Here we report the first radiation hybrid map of the river buffalo X chromosome generated from a recently constructed river buffalo (Bubalus bubalis) whole-genome radiation hybrid panel (BBURH5000). This map contains a total of 33 cattle-derived markers, including ten genes, four ESTs and 19 microsatellites. The markers are distributed in two linkage groups: LG1 contains eight markers spanning 125.6 cR, and LG2 contains 25 markers spanning 366.3 cR. The retention frequency (RF) of individual markers across the panel ranged from 7.8% to the gene UREB1 and 28,9 to the microsatellites MAF45 and INRA30. The BBUXRH5000 was compared with the bovine sequence assembly (build 3.1) and RH3000 bovine X chromosome maps and showed few rearrangements between these species, and possible mapping errors in one of the two species when compared with BTAX build 3.1. The use of cattle-derived primers using carried out successfully and the markers distribution along the chromosome was satisfactory, resulting in adequate coverage for a first mapping effort of this chromosome. Comparative analysis between BBUX and X chromosome from other mammalian species (human, hamster, sheep, horse and dog) were carried out showed extensive sinteny conservation of the X chromosome in the Mammalian Class, and gene order conservation between river buffalo and sheep and river buffalo and cattle. The BBUXRH5000 here presented is the start-pointing for the construction of high-resolution map, which is necessary for characterization of rearrangements occurring during evolution and futures studies in order to dissect economically important traits. / Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Coorientador: Mônica Regina Vendrame Amarante / Banca: Rosângela Hatori Rocha / Banca: Reinaldo Otávio Alves Alvarenga Brito / Banca: Hermione Elly Melara de Campos Bicudo / Banca: Mary Massumi Itoyama / Doutor

Resumo: O búfalo de rio (Bubalus bubalis) é uma espécie de interesse econômico pertencente à família Bovidae, utilizado para a produção de carne e leite, além de força de trabalho no campo. Recentemente, a construção de um painel de linhagens celulares contendo fragmentos do genoma do búfalo de rio, incorporado ao genoma de hamster (BBURH5000), está permitindo o mapeamento de todos os cromossomos bubalinos, representando a única ferramenta genômica desta categoria para o estudo da espécie. A utilização deste painel de células associado a análises estatísticas está gerando mapas genômicos de alta resolução contendo diferentes tipos de marcadores moleculares. O presente trabalho teve por objetivo utilizar este painel de células para a construção de um mapa genômico preliminar do braço curto do cromossomo 4 bubalino. Para tal, foram testados com o DNA bubalino, seqüências de oligonucleotídeos para PCR de 39 marcadores moleculares previamente mapeados no cromossomo 28 bovino, o qual foi descrito na literatura como o homólogo ao braço curto do cromossomo 4 de búfalo. Do total de marcadores testados, 14 (8 genes e 6 microssatélites) geraram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000. A freqüência de retenção de cada marcador no painel variou de 34,4%, para os marcadores, ANXA8, PPYR1 e ZNF33A a 43,3% para o marcador BMC6020. Utilizando os 14 marcadores, acrescidos de outros 10 marcadores (1 EST, 5 STS e 4 microssatélites) genotipados por pesquisadores da Texas A&M University, um mapa genômico RH preliminar foi construído para o braço curto do cromossomo 4 bubalino. A comparação desse mapa com mapas do cromossomo 28 bovino (BTA28) evidenciou extensa conservação na ordem dos marcadores no mapa obtido. / Abstract: The river buffalo (Bubalus bubalis), a member of the Bovidae family, is an economically important livestock specie useful to produce milk, meat, as well as source of labor. Recently, a whole-genome 5000-rad radiation hybrid panel was constructed for the river buffalo genome (BBURH5000 panel), which has been used to generated RH maps of several chromosomes from the specie. The goal of this study was to construct a preliminary RH map of the river buffalo chromosome 4 (BBU4p), using the BBURH5000 panel. Previous studies identified bovine chromosome 28 (BTA28) as homologous to BBU4p. Cattle derived PCR primers from 39 markers previously mapped in cattle, were tested with buffalo DNA. A total of 14 (8 genes and 6 microsatellites) of the 39 markers amplified PCR products suitable for the RH mapping. Retention frequencies of individual markers ranged from 34.4% for ANXA8, PPYR1 and ZNF33A to 43.3% for BMC6020. The preliminary RH map for BBU4p was constructed with a total of 24 markers, 14 from this study combined with 10 markers (1 EST, 5 STS and 4 microsatellites) genotyped by researchers at Texas A&M University. Comparisons of the BBU4p RH map with BTA28 revealed extensive conservation in the order of the mapped markers. Keywords: Bubalus bubalis; genome; river buffalo; RH mapping / Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientador: Claudia Regina Bonini-Domingos / Banca: Artur Luiz da Costa da Silva / Banca: Mary Massumi Itoyama / Mestre

Resumo: O Brasil é o país com o maior rebanho de búfalo de rio, Bubalus bubalis, no continente americano e também o maior produtor deste animal fora do continente asiático. A produção de leite e derivados vem aumentando devido à potencialidade dessa espécie em produzir leite com baixos custos e elevado rendimento industrial. Apesar das características economicamente importantes inerentes ao búfalo, as pesquisas científicas são limitadas em muitos países onde o búfalo é economicamente importante e como conseqüência a pesquisa genômica encontrase defasada quando comparado com outras espécies de interesse econômico. Marcadores moleculares são essenciais para avaliar informações qualitativas e quantitativas da diversidade molecular com o objetivo de aperfeiçoar a utilização e conservação da variabilidade genética e o relacionamento entre vários rebanhos. Microssatélites diferem dos outros tipos de seqüências de DNA por seu extenso polimorfismo dentro e entre populações, sendo considerados excelentes tipos de marcadores moleculares. O presente estudo teve como objetivos construir bibliotecas genômicas parciais enriquecidas com microssatélites, isolar e caracterizar os microssatélites obtidos, além de determinar as condições de amplificação por PCR para alguns dos locos isolados da biblioteca. Foram desenvolvidas 6 bibliotecas genômicas parciais - (CA)15 , (CT)15 , (AGG)8 , (GATA)8 , (GAAA)8, (AAAAC)8. O processo de clonagem gerou um total de 1.824 clones recombinantes, sendo que 954 foram seqüenciados para identificação de microssatélites. Cento e treze microssatélites foram encontrados. Desses, foram identificados 96 com unidade de repetição dinucleotídica (84,95%), 10 repetições trinucleotídicas (8,85%), 6 repetições tetranucleotídicas (5,3%) e 1 repetição pentanucleotídica (0,89%). As seqüências de microssatélites... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is the largest river buffalo (Bubalus bubalis) breeding center outside the Asian continent, the origin of the domestic buffalo. All buffalo breeds have a strong milk/meat attributes. Their extensive use in agriculture world wide, and especially in developing countries, begs for genetic resources to evaluate and improve traits important to local and regional economies. Among the different types of DNA markers, microsatellites are useful for studying genetic variability within and between populations due its high heterozygosity. The goal of this study was to construct partial genomic libraries enriched with repeated sequences to isolate and characterize microsatellites for river buffalo. The cloning process generated a total of 1824 recombinant clones, from which 954 were sequenced for the microsatellites search. One hundred and thirteen new microsatellites were isolated, containing the following type of repeats: dinucleotide repeats (96 sequences - 84.95%), trinucleotide repeats (10 sequences - 8.85%), tetranucleotide repeats (6 sequences - 5.3%) and pentanucleotide repeats (1 sequence - 0.89%). The new microsatellites were structurally categorized into 3 categories: pure repeats (90 sequences - 79.64%), pure interrupted (21 sequences - 18.59%) and compound interrupted repeats (2 sequence - 1.77%). PCR primer pairs were designed for ten microsatellites, from which four had the PCR conditions optimized. The microsatellites isolated in this study will be used to evaluate the genetic variability of Brazilian populations of river buffalo and to the gene mapping program established for this specie. / Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientador: Artur Luiz da Costa da Silva / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Sandra Regina de Carvalho Marchesin / Mestre

Resumo: O búfalo de rio (Bubalus bubalis) é uma espécie de interesse econômico pertencente à família Bovidae, utilizado para a produção de carne e leite, além de força de trabalho no campo, constituindo-se em um animal de tripla aptidão. Recentemente, a construção de um painel de células somáticas híbridas irradiadas (linhagens celulares) contendo fragmentos do genoma do búfalo de rio, incorporado ao genoma de hamster (BBURH5000), está permitindo, pela primeira vez, o mapeamento de todos os cromossomos bubalinos. A utilização desse painel de células associado a análises estatísticas, está gerando mapas genômicos de alta resolução contendo diferentes tipos de marcadores moleculares. O presente trabalho teve por objetivo utilizar este painel de células para gerar grupos de ligação com os marcadores mapeados no cromossomo 9 bubalino e assim comparar a organização dos grupos de ligação obtidos com aqueles já descritos para o cromossomo 7 bovino. Para tal, foram testados com DNA bubalino, seqüências de "primers" para PCR de 26 marcadores moleculares previamente mapeados no cromossomo 7 bovino, o qual foi descrito na literatura como o homólogo ao cromossomo 9 de búfalo. Do total de marcadores testados, 18 geraram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000, sendo que destes 18, foi possível a genotipagem final de 10 marcadores. A partir das análises de ligação com os 10 marcadores genotipados, foi possível distribuir os mesmos em três grupos de ligação no BBU9. A análise comparativa entre os grupos de ligação do BBU9 e do BTA7 revelou a presença dos mesmos grupos de ligação nos cromossomos de ambas espécies, evidenciando conservação de sintenia. / Abstract: The river buffalo (Bubalus bubalis), a member of the Bovidae family, is an economically important livestock specie useful to produce milk and meat, as well as source of labor, comprising an animal of triple aptness. The recent construction of a whole-genome 5000-rad radiation hybrid somatic cell panel for the river buffalo genome (BBURH5000), is allowing for the first time the mapping of all chromosomes from the specie. The use of BBURH5000 panel associated with statistical analyses is generating high-resolution RH maps integrating different types of molecular markers. The goal of this study was to genarate linkage groups with the markers mapped on the river buffalo chromosome 9 (BBU9), using the BBURH5000 panel, and then compare these groups with those already described in BTA7. Previous studies have identified bovine chromosome 7 as homologous to BBU9. Cattle derived PCR primers from 26 markers, previously mapped in cattle, were tested with buffalo DNA. A total of 18 of the 26 markers amplified PCR products suitable for RH mapping. From these 18 markers, it was possible the genotyping of 10. The analyses of linkage with the 10 markers genotyped turned possible to distribute them in three linkage groups on the BBU9. The comparative analyses between the linkage groups of BBU9 and BTA7 revealed the presence of the same linkage groups on the chromosome of both species, revealing conservation of synteny between them. / Orientadora: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientadora: Vera Fernanda Martins H. de Lima / Banca: Humberto Tonhati / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Mestre