Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-12-14Bitstream added on 2014-06-13T20:06:39Z : No. of bitstreams: 1 dellaqua_cpf_dr_botfmvz.pdf: 1556422 bytes, checksum: 1d36e424398f8b56c6af3fc18521061c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As biotécnicas de refrigeração e congelação podem causar danos irreversíveis à célula espermática devido ao estresse gerado pela queda de temperatura ou, no caso da criopreservação, pela formação de cristais de gelo intracelulares. Estas alterações resultam na diminuição da longevidade do espermatozóide no trato reprodutor da fêmea e, conseqüentemente, na queda dos índices de fertilidade. Sabendo-se que as alterações das características espermática afetam a viabilidade do sêmen sobre as diferentes formas de preservação seminal e que garanhões de diferentes taxas de fertilidade nem sempre apresentam diferenças significativas nas análises seminais padrões, faz-se necessário uma análise mais específica da células espermática, como a avaliação de vários parametros funcionais em células individuais, o que possivelmente reduziria as incertezas inerentes a previsão da fertilidade na avaliação in vitro do sêmen. Para comprovação desta hipótese três experimentos foram realizados. No experimento 1 o objetivo foi identificar e avaliar as principais modificações ocorridas nas características morfofuncionais do sêmen equino estocado a temperatura ambiente (18-22ºC) por um período de 12 horas. No experimento 2 o objetivo foi verificar a possibilidade de modular estas alterações através de duas temperaturas de refrigeração (5ºC e 15ºC), e, no experimento 3, o objetivo foi avaliar e verificar a relação destas alterações com os índices de fertilidade em sêmen congelado. Para os experimentos 1 e 2, três ejaculados de seis diferentes garanhões foram avaliados quanto a cinética espermática através da análise computadorizada do movimento espermático; para a avaliação morfofuncional foram avaliadas a integridade das membranas plasmática... / Cooling and freezing can cause irreversible damage to sperm cells due to the stress generated by the decrease in temperature or, in the case of cryopreservation, the formation of intracellular ice crystals. These changes result in decreased longevity of sperm in the female reproductive tract and, consequently, a decrease in fertility rates. The changes in sperm characteristics affect the viability of the semen, and these changes vary based on the different preservation techniques used to preserve the semen from different stallions. In addition, fertility rates do not always show significant differences in semen analysis patterns. Therefore, a more specific analysis of sperm cells is necessary. This analysis should include a functional assessment of multiple parameters in individual cells, which might reduce uncertainties in the prediction of fertility based on the in vitro evaluation of semen. To test this hypothesis, three experiments were performed. In experiment 1, the objective was to identify and assess the main characteristic morph functional changes in equine semen that is stored at room temperature (18-22°C) for a period of 12 hours. In experiment 2, the objective was to determine the possibility of modulating these changes using two refrigeration temperatures (5°C and 15°C). In experiment 3, the objective was to evaluate and compare the influence of these changes on fertility rates between semen at various temperatures and in frozen semen. For experiments 1 and 2, the sperm kinetics of three different ejaculates from six stallions were evaluated using a computerized analysis of sperm motility. For morphological and functional assessments, the following parameters were evaluated: plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, rate of DNA fragmentation, caspase activation and... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: Rubens Paes de Arruda / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Andre Maciel Crespilho / Resumo: As biotécnicas de refrigeração e congelação podem causar danos irreversíveis à célula espermática devido ao estresse gerado pela queda de temperatura ou, no caso da criopreservação, pela formação de cristais de gelo intracelulares. Estas alterações resultam na diminuição da longevidade do espermatozóide no trato reprodutor da fêmea e, conseqüentemente, na queda dos índices de fertilidade. Sabendo-se que as alterações das características espermática afetam a viabilidade do sêmen sobre as diferentes formas de preservação seminal e que garanhões de diferentes taxas de fertilidade nem sempre apresentam diferenças significativas nas análises seminais padrões, faz-se necessário uma análise mais específica da células espermática, como a avaliação de vários parametros funcionais em células individuais, o que possivelmente reduziria as incertezas inerentes a previsão da fertilidade na avaliação in vitro do sêmen. Para comprovação desta hipótese três experimentos foram realizados. No experimento 1 o objetivo foi identificar e avaliar as principais modificações ocorridas nas características morfofuncionais do sêmen equino estocado a temperatura ambiente (18-22ºC) por um período de 12 horas. No experimento 2 o objetivo foi verificar a possibilidade de modular estas alterações através de duas temperaturas de refrigeração (5ºC e 15ºC), e, no experimento 3, o objetivo foi avaliar e verificar a relação destas alterações com os índices de fertilidade em sêmen congelado. Para os experimentos 1 e 2, três ejaculados de seis diferentes garanhões foram avaliados quanto a cinética espermática através da análise computadorizada do movimento espermático; para a avaliação morfofuncional foram avaliadas a integridade das membranas plasmática... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cooling and freezing can cause irreversible damage to sperm cells due to the stress generated by the decrease in temperature or, in the case of cryopreservation, the formation of intracellular ice crystals. These changes result in decreased longevity of sperm in the female reproductive tract and, consequently, a decrease in fertility rates. The changes in sperm characteristics affect the viability of the semen, and these changes vary based on the different preservation techniques used to preserve the semen from different stallions. In addition, fertility rates do not always show significant differences in semen analysis patterns. Therefore, a more specific analysis of sperm cells is necessary. This analysis should include a functional assessment of multiple parameters in individual cells, which might reduce uncertainties in the prediction of fertility based on the in vitro evaluation of semen. To test this hypothesis, three experiments were performed. In experiment 1, the objective was to identify and assess the main characteristic morph functional changes in equine semen that is stored at room temperature (18-22°C) for a period of 12 hours. In experiment 2, the objective was to determine the possibility of modulating these changes using two refrigeration temperatures (5°C and 15°C). In experiment 3, the objective was to evaluate and compare the influence of these changes on fertility rates between semen at various temperatures and in frozen semen. For experiments 1 and 2, the sperm kinetics of three different ejaculates from six stallions were evaluated using a computerized analysis of sperm motility. For morphological and functional assessments, the following parameters were evaluated: plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, rate of DNA fragmentation, caspase activation and... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As espécies reativas de oxigênio são fundamentais na fisiologia espermática. No entanto, um desequilíbrio entre a produção e a capacidade antioxidante caracteriza o estresse oxidativo (EO). O espermatozoide é extremamente suscetível ao EO pois, dentre outras características, a membrana plasmática é rica em ácidos graxos poli-insaturados responsáveis por promoverem a fluidez necessária em processos fisiológicos como motilidade e fertilização. Por outro lado, essas insaturações são mais facilmente oxidadas e vulneráveis à peroxidação lipídica. Em função desta susceptibilidade, estas células dependem fortemente de compostos presentes no plasma seminal (PS) para a proteção contra esse evento. Dessa forma, a carnosina, dipeptídeo presente no PS pode ser uma das responsáveis pela proteção contra o acúmulo do MDA. No entanto, durante a criopreservação do sêmen equino é necessário retirar o PS. Em estudo recente, verificamos que esta remoção, torna os espermatozoides sensíveis ao subproduto extremamente deletério da peroxidação lipídica, o malondialdeído (MDA). Como a carnosina é removida junto com o plasma seminal durante a criopreservação, foram desenvolvidos 2 experimentos sequenciais visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado com adição de carnosina. Amostras de sêmen de sete garanhões foram tratadas com concentrações crescentes de carnosina adicionadas ao diluidor (1mM, 50mM e 100mM). Após a descongelação, as amostras foram divididas retrospectivamente em grupos de alta congelabilidade (AC: motilidade maior que 30%) e baixa congelabilidade (BC: motilidade menor que 30%). Amostras tratadas com 50mM apresentaram menor porcentagem de células com lesão de membrana plasmática e, quando tratadas com 100mM, células com maior amplitude do deslocamento lateral de cabeça. Amostras controle BC apresentaram menor porcentagem de células com DNA íntegro em relação às amostras AC. No entanto, houve um leve aumento na porcentagem de células com DNA íntegro em amostras BC com 100mM, não diferindo das amostras AC. Por outro lado, amostras BC criopreservadas com 50mM apresentaram maiores porcentagens de células com escore calculado de potencial de membrana mitocondrial e mais suscetíveis ao EO em relação ao controle. Apesar da proteção parcial, a maior suscetibilidade à peroxidação lipídica torna-se um problema, especialmente pelo fato de que espermatozoides equinos são mais suscetíveis ao MDA. Um motivo para este efeito seria a afinidade da carnosina em reagir com açúcares, o que poderia influenciar negativamente a atividade mitocondrial e o status oxidativo, ao diminuir a produção de piruvato pela via glicolítica. Desta forma, no experimento 2, amostras BC foram tratadas com a combinação de carnosina (0 e 50mM) e piruvato (0 e 5mM) em arranjo fatorial 2x2. Verificou-se que o tratamento com piruvato (5mM) proporcionou menos células com baixa atividade mitocondrial. Por outro lado, a carnosina (50mM), promoveu maior motilidade total, progressiva e células rápidas. Houve uma tendência de aumento nas células com velocidade progressiva e atividade mitocondrial na combinação de tratamentos. Não houve diferença entre os grupos na suscetibilidade ao EO que, no entanto, correlacionou-se negativamente com células móveis, rápidas e integridade de membrana plasmática e acrossomal. Estes resultados indicam que subprodutos da peroxidação lipídica, sendo o principal deles o MDA, podem causar danos ao DNA, às mitocôndrias e à cinética espermática. Neste contexto, a carnosina (100mM) parece ter um leve efeito protetor ao DNA contra o acúmulo de MDA. Além disto, 50mM de carnosina parece auxiliar na manutenção da velocidade progressiva e atividade mitocondrial quando associada ao piruvato (5mM). Assim, a carnosina e o piruvato podem ser utilizados na prevenção de crioinjúrias em amostras de baixa congelabilidade. / Reactive oxygen species (ROS) plays a key role in the sperm physiology. However, an imbalance between ROS production and antioxidant capacity characterize the oxidative stress (OE). The spermatozoa are extremely susceptible to EO because, among other characteristics, the plasma membrane is rich in polyunsaturated fatty acids responsible for promoting fluidity necessary in physiological processes such as motility and fertilization. However, these unsaturations are more easily oxidized and vulnerable to lipid peroxidation. Due to this susceptibility, these cells strongly depend on compounds present in the seminal plasma (SP) to protect against this event. Thus, carnosine, a dipeptide present in SP of stallions, may be a key factor on the protection against MDA accumulation. Nevertheless, during the equine sperm cryopreservation process, SP is removed. In a recent study, we observed that seminal plasma removal led to an increased susceptibility of equine spermatozoa to extremely deleterious product of lipid peroxidation, malondialdehyde (MDA). As the carnosine is removed together with the seminal plasma during cryopreservation, two sequential experiments were developed aiming to improve the quality of stallion cryopreserved semen by means of carnosine therapy. Samples from seven stallions were treated with increasing concentrations of carnosine added to the extender (1mM, 50mM and 100mM) and submitted to cryopreservation. After thawing, samples were classified as high freezeability (HF: total motility greater than 30%) and low freezeability (LF: total motility lower than 30%). Samples treated with 50mM presented lower percentage of sperm showing plasma membrane damage and, when treated with 100mM, a greater amplitude of the lateral head displacement was observed. Untreated LF samples showed a lower percentage of cells showing intact DNA in relation to HF samples. By contrast, when LF samples were treated with 100mM, there was an increase in the percentage of cells with intact DNA, which was similar to the HF samples. On the other hand, LF samples cryopreserved with 50mM had a higher percentage of cells showing high calculated mitochondrial membrane potential score and increased susceptibility to OE in relation to the control. Despite the partial protection, the increased susceptibility to lipid peroxidation is a concern since equine spermatozoa is highly vulnerable to the MDA. Those results could be due to the affinity of carnosine to react with sugars, which could negatively influence mitochondrial activity and an oxidative state by decreasing pyruvate production. Hence, in experiment 2, LF samples were treated with a combination of carnosine (0 and 50mM) and pyruvate (0 and 5mM) in a 2x2 factorial arrangement. We observed that samples treated with pyruvate (5mM) had decreased percentage of cells with low mitochondrial activity. On the other hand, carnosine (50mM) increased total motility, progressive motility and fast cells. We also observed a tendency to increased progressive velocity and mitochondrial activity in the combination of treatments. There was no difference on sperm susceptibility to OE between treatments. However, this variable correlated negatively with the percentage of motile and rapid cells as well as those showing intact membrane and acrosome. These results indicate that the byproduct of lipid peroxidation (MDA) may cause damage to DNA, mitochondria and sperm kinetics. In this context, carnosine (100mM) appears to have a mild protective effect on DNA against the accumulation of MDA. Furthermore, 50mM of carnosine seems to improve progressive velocity and mitochondrial activity when associated with pyruvate (5mM). Thus, carnosine and pyruvate can be used on cryoinjuries prevention in low freezeability samples.

As espécies reativas de oxigênio são fundamentais na fisiologia espermática. No entanto, um desequilíbrio entre a produção e a capacidade antioxidante caracteriza o estresse oxidativo (EO). O espermatozoide é extremamente suscetível ao EO pois, dentre outras características, a membrana plasmática é rica em ácidos graxos poli-insaturados responsáveis por promoverem a fluidez necessária em processos fisiológicos como motilidade e fertilização. Por outro lado, essas insaturações são mais facilmente oxidadas e vulneráveis à peroxidação lipídica. Em função desta susceptibilidade, estas células dependem fortemente de compostos presentes no plasma seminal (PS) para a proteção contra esse evento. Dessa forma, a carnosina, dipeptídeo presente no PS pode ser uma das responsáveis pela proteção contra o acúmulo do MDA. No entanto, durante a criopreservação do sêmen equino é necessário retirar o PS. Em estudo recente, verificamos que esta remoção, torna os espermatozoides sensíveis ao subproduto extremamente deletério da peroxidação lipídica, o malondialdeído (MDA). Como a carnosina é removida junto com o plasma seminal durante a criopreservação, foram desenvolvidos 2 experimentos sequenciais visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado com adição de carnosina. Amostras de sêmen de sete garanhões foram tratadas com concentrações crescentes de carnosina adicionadas ao diluidor (1mM, 50mM e 100mM). Após a descongelação, as amostras foram divididas retrospectivamente em grupos de alta congelabilidade (AC: motilidade maior que 30%) e baixa congelabilidade (BC: motilidade menor que 30%). Amostras tratadas com 50mM apresentaram menor porcentagem de células com lesão de membrana plasmática e, quando tratadas com 100mM, células com maior amplitude do deslocamento lateral de cabeça. Amostras controle BC apresentaram menor porcentagem de células com DNA íntegro em relação às amostras AC. No entanto, houve um leve aumento na porcentagem de células com DNA íntegro em amostras BC com 100mM, não diferindo das amostras AC. Por outro lado, amostras BC criopreservadas com 50mM apresentaram maiores porcentagens de células com escore calculado de potencial de membrana mitocondrial e mais suscetíveis ao EO em relação ao controle. Apesar da proteção parcial, a maior suscetibilidade à peroxidação lipídica torna-se um problema, especialmente pelo fato de que espermatozoides equinos são mais suscetíveis ao MDA. Um motivo para este efeito seria a afinidade da carnosina em reagir com açúcares, o que poderia influenciar negativamente a atividade mitocondrial e o status oxidativo, ao diminuir a produção de piruvato pela via glicolítica. Desta forma, no experimento 2, amostras BC foram tratadas com a combinação de carnosina (0 e 50mM) e piruvato (0 e 5mM) em arranjo fatorial 2x2. Verificou-se que o tratamento com piruvato (5mM) proporcionou menos células com baixa atividade mitocondrial. Por outro lado, a carnosina (50mM), promoveu maior motilidade total, progressiva e células rápidas. Houve uma tendência de aumento nas células com velocidade progressiva e atividade mitocondrial na combinação de tratamentos. Não houve diferença entre os grupos na suscetibilidade ao EO que, no entanto, correlacionou-se negativamente com células móveis, rápidas e integridade de membrana plasmática e acrossomal. Estes resultados indicam que subprodutos da peroxidação lipídica, sendo o principal deles o MDA, podem causar danos ao DNA, às mitocôndrias e à cinética espermática. Neste contexto, a carnosina (100mM) parece ter um leve efeito protetor ao DNA contra o acúmulo de MDA. Além disto, 50mM de carnosina parece auxiliar na manutenção da velocidade progressiva e atividade mitocondrial quando associada ao piruvato (5mM). Assim, a carnosina e o piruvato podem ser utilizados na prevenção de crioinjúrias em amostras de baixa congelabilidade. / Reactive oxygen species (ROS) plays a key role in the sperm physiology. However, an imbalance between ROS production and antioxidant capacity characterize the oxidative stress (OE). The spermatozoa are extremely susceptible to EO because, among other characteristics, the plasma membrane is rich in polyunsaturated fatty acids responsible for promoting fluidity necessary in physiological processes such as motility and fertilization. However, these unsaturations are more easily oxidized and vulnerable to lipid peroxidation. Due to this susceptibility, these cells strongly depend on compounds present in the seminal plasma (SP) to protect against this event. Thus, carnosine, a dipeptide present in SP of stallions, may be a key factor on the protection against MDA accumulation. Nevertheless, during the equine sperm cryopreservation process, SP is removed. In a recent study, we observed that seminal plasma removal led to an increased susceptibility of equine spermatozoa to extremely deleterious product of lipid peroxidation, malondialdehyde (MDA). As the carnosine is removed together with the seminal plasma during cryopreservation, two sequential experiments were developed aiming to improve the quality of stallion cryopreserved semen by means of carnosine therapy. Samples from seven stallions were treated with increasing concentrations of carnosine added to the extender (1mM, 50mM and 100mM) and submitted to cryopreservation. After thawing, samples were classified as high freezeability (HF: total motility greater than 30%) and low freezeability (LF: total motility lower than 30%). Samples treated with 50mM presented lower percentage of sperm showing plasma membrane damage and, when treated with 100mM, a greater amplitude of the lateral head displacement was observed. Untreated LF samples showed a lower percentage of cells showing intact DNA in relation to HF samples. By contrast, when LF samples were treated with 100mM, there was an increase in the percentage of cells with intact DNA, which was similar to the HF samples. On the other hand, LF samples cryopreserved with 50mM had a higher percentage of cells showing high calculated mitochondrial membrane potential score and increased susceptibility to OE in relation to the control. Despite the partial protection, the increased susceptibility to lipid peroxidation is a concern since equine spermatozoa is highly vulnerable to the MDA. Those results could be due to the affinity of carnosine to react with sugars, which could negatively influence mitochondrial activity and an oxidative state by decreasing pyruvate production. Hence, in experiment 2, LF samples were treated with a combination of carnosine (0 and 50mM) and pyruvate (0 and 5mM) in a 2x2 factorial arrangement. We observed that samples treated with pyruvate (5mM) had decreased percentage of cells with low mitochondrial activity. On the other hand, carnosine (50mM) increased total motility, progressive motility and fast cells. We also observed a tendency to increased progressive velocity and mitochondrial activity in the combination of treatments. There was no difference on sperm susceptibility to OE between treatments. However, this variable correlated negatively with the percentage of motile and rapid cells as well as those showing intact membrane and acrosome. These results indicate that the byproduct of lipid peroxidation (MDA) may cause damage to DNA, mitochondria and sperm kinetics. In this context, carnosine (100mM) appears to have a mild protective effect on DNA against the accumulation of MDA. Furthermore, 50mM of carnosine seems to improve progressive velocity and mitochondrial activity when associated with pyruvate (5mM). Thus, carnosine and pyruvate can be used on cryoinjuries prevention in low freezeability samples.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-08-01T13:36:14Z No. of bitstreams: 1 Amanda Baricatti Finazzi.pdf: 587738 bytes, checksum: 3544755ab40549d4e228afdfc83d9c20 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-01T13:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Baricatti Finazzi.pdf: 587738 bytes, checksum: 3544755ab40549d4e228afdfc83d9c20 (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study aimed to evaluate the effect of a colloid in single layer centrifugation (AndroColl®-E; Minitub, Germany) associated to three freezing extenders: extender 1 (Botucrio®; Biotech, Botucatu,, Brazil), extender 2 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Germany + 3% glycerol) and extender 3 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Germany + 3% DMSO) on equine semen quality. We used three ejaculates from five stallion (n=15), collected by artificial vagina. After collection, the semen was diluted with extender to from skimmed milk (EquiPlus®, Minitub, Germany) and divided into 2 groups: group E (centrifuged without colloid) and group A (centrifuged with colloid). No grupo E, o sêmen foi centrifugado à 676g por 15 minutos, no grupo A, o sêmen foi centrifugado à 314g por 20 minutos. Após a centrifugação, os grupos receberam os diferentes diluentes: diluente 1, diluente 2 e diluente 3. The kinetics was evaluated by CASA and the integrity of plasma and acrossomal membrane by association of fluorescent probes and subjected to flow cytometry. With respect to the CASA parameters, it can be seen that the A1 group, with the colloid centrifuged, had superior result in LIN and WOB variables, compared to the E1 group. The variables, RAP, VCL, VAP, ALH and BCF, had lower results when centrifuged with colloid, A1 group than in the group E1. With respect to the integrity of plasma and acrosomal membrane, it can be seen that A1 and A3 groups were centrifuged with colloid, they had superior result to E1 and E3 groups, which were centrifuged without the colloid. The use of colloid improved integrity of plasma and acrosomal membranes probably avoided the process of sperm hyperactivation and provided lower production of ROS. Greater in vivo studies are needed to prove this technique. / Objetivou-se avaliar o efeito da centrifugação em coloide de camada única (AndroColl®-E; Minitub, Alemanha) e três diluentes de congelamento: diluente 1 (Botucrio®; Biotech, Botucatu, Brasil), diluente 2 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Alemanha + 3% glicerol) e diluente 3 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Alemanha + 3% DMSO), sobre a qualidade do sêmen equino. Utilizou-se 3 ejaculados de 5 garanhões (n=15). Após a colheita, o sêmen foi diluído com meio à base de leite desnatado (EquiPlus®, Minitub, Alemanha) e dividido em 2 grupos: grupo E (centrifugado sem coloide) e grupo A (centrifugado com coloide). No grupo E, o sêmen foi centrifugado à 676g por 15 minutos, no grupo A, o sêmen foi centrifugado à 314g por 20 minutos. Após a centrifugação, os grupos receberam os diferentes diluentes: diluente 1, diluente 2 e diluente 3. Logo após foram levadas ao congelamento em máquina programável portátil e armazenadas em botijões criogênicos. A cinética foi avaliada pelo CASA e a integridade das membranas plasmática e acrossomal, por associação de sondas fluorescentes submetidas ao Citômetro de Fluxo. Com relação aos parâmetros do CASA, pode-se observar que o grupo A1, centrifugado com o coloide, teve resultado superior nas variáveis LIN e WOB, comparadas com o grupo E1. Já as variáveis, RAP, VCL, VAP, ALH e BCF, tiveram resultados inferiores quando centrifugadas com o colóide, grupo A1 em relação ao grupo E1. Com relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, pode-se observar que os grupos A1 e A3, que foram centrifugados com o coloide, tiveram resultado superior aos grupos E1 e E3, que foram centrifugados sem o coloide. O uso do coloide melhorou integridade das membranas plasmática e acrossomal, provavelmente evitou o processo da hiperativação espermática e proporcionou menor produção de ROS. Maiores estudos in vivo serão necessários para comprovação desta técnica.