Nous nous intéressons à la production de peptides bioactifs dans des laits fermentés par la bactérie lactique Streptococcus thermophilus. Pour ce faire, il est nécessaire que cette bactérie en internalise le moins possible lors de sa croissance. Il était donc important de caractériser le système protéolytique S. thermophilus. Tout d’abord, les relations phylogéniques liant 30 souches de S. thermophilus ont été recherchées par MLST. Ensuite, un système de transport de type ABC qui semble fonctionnel a été identifié chez la souche LMD-9 et appelé OTS. Une étude de la variabilité des systèmes de transport Ami et OTS des 30 souches de S. thermophilus a été réalisée. Enfin, l’hydrolyse des caséines par la protéase PrtS de S. thermophilus a été étudiée. Cette protéase habituellement ancrée à la paroi de la bactérie est retrouvée chez la souche 4F44 également sous forme libre. La séquence protéique de PrtS4F44, différente de celle de PrtS de la souche LMD 9 (PrtSLMD-9), n’est pas la cause de la libération partielle de PrtS4F44. La sortase A, acteur de l’ancrage de PrtS à la paroi de la bactérie, présente chez la souche 4F44 (srtA4F44) un allèle différent de celui de la souche LMD-9 (srtALMD-9). En effet, PrtSLMD-9 se trouve libérée lorsque srtALMD-9 est remplacée par srtA4F44 dans la souche LMD-9 montrant ainsi que SrtA4F44 est déficiente, entrainant par conséquent un défaut d’ancrage de PrtS4F44 et sa libération partielle dans le milieu extracellulaire. L’hydrolyse des caséinates bovines totales par la forme libre de PrtS4F44 a permis d’obtenir des peptides bioactifs qui pourront être utilisés pour la fonctionnalisation de produits laitiers fermentés / We are interested in the production of bioactive peptides in fermented milk by the lactic acid bacterium Streptococcus thermophilus. For this, it requires that the bacterium internalize them as few as possible during its growth. Therefore, it was important to characterize the proteolytic system of S. thermophilus. First, phylogenetic relationships linking 30 S. thermophilus strains have been searched by MLST. Secondly, an ABC-type transport system which seems to be functional was identified in the LMD-9 strain and named OTS. A study of the variability of Ami and OTS transport systems of the 30 strains of S. thermophilus was performed. Finally, the hydrolysis of caseins by proteinase PrtS of S. thermophilus was studied. This proteinase usually anchored to the wall of the bacterium was also found in a free form in strain 4F44. The protein sequence of PrtS4F44, different from the one of PrtS in the LMD-9 strain (PrtSLMD-9), is not the cause of the partial release of PrtS4F44. Sortase A, the actor of the anchoring of PrtS to the wall of the bacteria, presents different alleles between the strain 4F44 (srtA4F44) and the LMD-9 strain (srtALMD-9). Indeed, PrtSLMD-9 is released when srtALMD-9 is replaced by srtA4F44 in the strain LMD-9 showing that SrtA4F44 is deficient, causing consequently a default of PrtS4F44 anchoring and its partial release into the extracellular medium. Additionally, hydrolysis of bovine caseinates was performed using the free form PrtS4F44 and allowed the production of bioactive peptides that can be used for the functionalization of fermented dairy products

Lactic acid bacteria are associated with preservation of foods, including milk, meat and vegetables. Yoghurt is produced by the cooperative action of two starter bacteria / S. thermophilus and L. delbrueckii subsp. bulgaricus. In this study, identification and typing of yoghurt starter bacteria were aimed. Traditional home made yoghurts were collected from different areas of Turkey, identification of those isolates at species and subspecies level and typing at strain level were achieved using PCR based methods. In our study, identification of yogurt starter bacteria was studied using species specific primers and ARDRA. These methods were inefficient in identification of yoghurt starter bacteria, at species and subspecies level. Consequently, a reliable and quick method for accurate identification of yoghurt starter bacteria was developed. The new method focuses on amplification of methionine biosynthesis genes, for selective identification of yoghurt starter bacteria together with some cheese starters. Further discrimination by ARDRA enabled differentiation of yoghurt starter bacteria from cheese starters. Confirmation of the proposed method has been accomplished by partial sequencing of the 16S rRNA gene. After correct identification of starter bacteria had been achieved, the strains were typed at strain level using RAPD-PCR and MLST. RAPD-PCR with primer 1254 resulted better fingerprints, compared to primer M13 at strain level. Comparisons of the two typing methods showed that RAPD-PCR revealed strain diversity better than MLST, however MLST was a more robust and reliable method and resulted in clustering of the strains depending on the isolation source.

Streptococcus thermophilus est la bactérie lactique la plus utilisée après Lactococcus lactis dans l'industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de fromages à pâte cuite (Emmental, gruyère), filée (Mozarella) ou pressée (Cheddar). Il s'agit du seul streptocoque à avoir le statut de bactérie GRAS (Generally Recognized As Safe). Dans un premier temps le potentiel probiotique de 30 souches de S. thermophilus de différentes origines a été testé par l'étude de leurs capacités à résister aux différentes conditions de stress rencontrées pendant leur passage dans le tractus gastro-intestinal (bas pH, sels biliaires et stress oxydant), de leur capacité à adhérer aux cellules épithéliales intestinales et de leurs propriétés immunomodulatrices. La majorité des souches réduit la production d'interleukine IL-8 (pro-inflammatoire) alors qu'elles induisent la production d'interleukine IL-10 (anti-inflammatoire) et l'IL-12 (pro-inflammatoire). Sur la base du rapport IL-10/IL-12, qui permet d'apprécier le potentiel anti-inflammatoire d'une souche, nous avons observé que certaines d'entre-elles pourraient avoir un fort potentiel anti-inflammatoire. L'Analyse en Composantes Principales (ACP) nous a permis de séparer les souches en 6 catégories différentes présentant des propriétés distinctes. A l'intérieur de chaque classe, une variabilité entre les souches a été observée et des caractéristiques intéressantes identifiées. Cependant, aucune des classes ne peut être considérée comme contenant le probiotique « parfait ». Suite à cette étude et sur la base de sa résistance aux stress gastriques et de ses capacités d'adhésion, et sachant que la séquence de son génome est disponible, la souche LMD-9 a été sélectionnée pour la deuxième partie de ce travail, à savoir la construction d'un outil basé sur la technologie R-IVET pour étudier l'état physiologique de S. thermophilus dans le tractus digestif. L'outil R-IVET mis au point se compose de deux éléments: un vecteur plasmidique portant le gène cre codant une recombinase spécifique dépourvu de son promoteur et une cassette chromosomique composée d'un gène de résistance à la spectinomycine flanqué par des sites loxP, reconnus par la recombinase Cre. La fonctionnalité de l'outil R-IVET a ensuite été testée par le clonage de trois promoteurs différents de S. thermophilus (PprtS, Pshsp and Plac) en amont de cre. Le système a été valide in vitro avec les trois promoteurs et in vivo avec le promoteur Plac / Streptococcus thermophilus is a lactic acid bacterium used after Lactococcus lactis in the dairy industry for the production of yogurt and cheeses like Emmental, Gruyere, Mozarella and Cheddar. It is the only streptococcus to have the GRAS (Generally Recognized As Safe) status. In this work, the probiotic potential of 30 S. thermophilus strains from different origins was tested by studying their ability to resist different stress conditions encountered during their passage through the GIT (low pH, bile salts and oxidative stress), their ability to adhere to intestinal epithelial cells and their immunomodulatory properties. Majority of the strains reduced the production of interleukin IL-8 (pro-inflammatory) and induced the production of interleukin IL-10 (anti-inflammatory) and IL-12 (pro-inflammatory). On the basis of the ratio IL-10/IL-12 which allows to evaluate the anti-inflammatory potential of a probiotic, several strains appeared to have a high the anti-inflammatory potential. Principal Component Analysis (PCA) allowed us to classify strains in 6 different categories with different properties. Within each class, variability and interesting features were observed, but none of the classes could be considered as containing the perfect probiotic. Following this study and on the basis of its resistance to gastric stress and its adhesion capacity and knowing that its genome sequence is available, the strain LMD-9 was selected for the second part of this work, namely the construction of a tool based on R-IVET to study the physiological state of S. thermophilus in the digestive tract. This tool is composed of two elements: a plasmid vector (pULNcreB), carrying the gene cre encoding a site-specific recombinase without its promoter and a chromosomal cassette composed of a gene of resistance to spectinomycin flanked by loxP sites which are recognized by the recombinase Cre. The functionality of the tool R-IVET was then tested by cloning three different promoters of S. thermophilus (PprtS, Pshsp and Plac) upstream of cre. System was valid in vitro with all the three promoters and in vivo by using the lactose operon promoter Plac