FERREIRA, José Roberto de Oliveira. Avaliação do potencial citotóxico de três novos derivados da a-santonina em modelos experimentais in vitro. 2009. 86 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-04-12T12:35:06Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_jroferreira.pdf: 720293 bytes, checksum: a4d2e7d3d42fdf2d1311fb27cbe778ce (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-04-13T16:16:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_jroferreira.pdf: 720293 bytes, checksum: a4d2e7d3d42fdf2d1311fb27cbe778ce (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-13T16:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_jroferreira.pdf: 720293 bytes, checksum: a4d2e7d3d42fdf2d1311fb27cbe778ce (MD5) Previous issue date: 2009 / The sesquiterpene lactones have different chemical structures, and a variety of biological activities, among which stand out the cytotoxic and antitumour activities. The aim of the present study was to determine the cytotoxic effects of three new α-Santonin (1) derivatives: 3-oxo-7αH,6H-eudesma-1,4,11-trien-6,12-olide (2), 11,13-dehydrolumissantonin (3) and 10α-acetoxi-3-oxo-1,7αH,6H-guai-4,11-dien-6,12-olide (4) and study your effects on cell proliferation, cell cycle, and apoptosis events. All new derivatives inhibited the proliferation of tumor cells, by MTT assay, except the prototype (α-santonina) after 72 h of incubation. The cell lines HL60 (leukemia) and HCT-8 (colon) showed greater sensitivity to treatment with these derivatives, with values of IC50 for HL60 equal to 1.14 (0.23-2.77); 2.30 (1.87-2.84) and 1.60 (1.09-2.35) µM and for HCT-8 equal to 2.92(0.98-4.86); 1.96 (1.64-2.29) and 0.36 (0.16-0.79) µM for compounds 2, 3 and 4, respectively.. Two derivatives were less cytotoxic to peripheral blood mononuclear cells (PBMC): IC50 equal to 10.75 (4.6-23.3) µM (3) and IC50 equal to 16.77 (7.3-36.8) µM (4). However, compound 2 showed lower selectivity (IC50 equal to 3.24 (1.6-5.3) µM) on PBMC. None of the studied compounds induced hemolytic effects. To evaluate the mechanism of action promoted by these derivatives, HL60 cells was chosen as an experimental model, since this linage was one of the most sensitive to treatment. HL60 cultures were treated with α-santonin derivatives (1 and 2 µM) during 24 h. All compounds were able to reduce the number of viable cells evaluated by the trypan blue dye exclusion test at highest concentration, without increasing the number of non-viable cells. The antiproliferative action is related to the ability to inhibit the synthesis of DNA. After treatment, the derivatives were able to induce apoptosis, as observed by cell morphology pattern (chromatin condensation, and nuclear fragmentation), and by flow cytometry (membrane integrity, DNA fragmentation, anexin positive cells, and caspases 3 and 7 activation). None of all derivatives analyzed caused depolarization of mitochondrial membrane, suggesting the involvement of the extrinsic pathway in the apoptotic process. The compounds 3 and 4 induce G2/M cell cycle arrest, indicating a different mechanism of action in relation to compound 2. These data suggest that α-santonin derivatives evaluated in the present study showed a anticancer potential, especially the compound 4, which induced moderate toxicity on PBMC, in addition this compound induced a higher rate of cell death via apoptosis when compared to the other α-santonin derivatives evaluated. / As lactonas sesquiterpênicas apresentam estruturas químicas diversificadas, bem como uma grande variedade de atividades biológicas, dentre as quais se destaca a atividade citotóxica e antitumoral. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial citotóxico de três novos derivados da α-santonina (1): 3-oxo-7αH,6H-eudesma-1,4,11-trien-6,12-olideo (2), 11,13-dehidrolumissantonina (3) e 10α-acetoxi-3-oxo-1,7αH,6H-guai-4,11-dien-6,12-olideo (4) e estudar seus efeitos sobre a proliferação celular, ciclo celular e eventos apoptóticos. Todos os novos derivados inibiram a proliferação das células tumorais, pelo ensaio do MTT, exceto o protótipo (α-santonina), após 72 h de incubação. As linhagens HL60 (leucemia) e HCT-8 (cólon) mostraram maior sensibilidade ao tratamento com os novos derivados, cujos valores de CI50 para HL60 foram 1,14 (0,23-2,77); 2,30 (1,87-2,84) e 1,60 (1,09-2,35) µM e HCT-8 iguais a 2,92(0,98-4,86); 1,96 (1,64-2,29)e 0,36 (0,16-0,79) µM, para os compostos 2, 3 e 4, respectivamente. Dois dos três derivados foram menos citotóxicos para as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com CI50 igual a 10,75 (4,6-23,3) µM (3) e CI50 igual a 16,77 (7,3-36,8) µM (4). Porém, o composto 2 apresentou menor seletividade (CI50 igual a 3,24 (1,6-5,3) µM) em relação as células não tumorais. Nenhum dos compostos estudados induziu efeitos hemolíticos. Para estudo do mecanismo de ação foi escolhida a linhagem HL-60 como modelo experimental. Culturas de HL60 foram tratadas com os derivados (1 e 2 µM) por 24 h. Todos os derivados foram capazes de reduzir o número de células viáveis, avaliado pelo ensaio de exclusão do azul de tripan, na maior concentração testada, sem induzir aumento na incidência de células não viáveis. A ação antiproliferativa esta relacionada com a capacidade de inibir a síntese de DNA. Após o tratamento, os derivados foram capazes de induzir apoptose, como observado pelo padrão de morfologia celular: presença de condensação de cromatina e fragmentação nuclear, bem como por citometria de fluxo (manutenção da integridade de membrana plasmática, fragmentação do DNA, externalização da fosfatidilserina e ativação de caspases 3 e 7). Nenhum dos derivados causou despolarização da membrana mitocondrial, sugerindo a participação da via extrínseca no processo apoptótico. Os compostos 3 e 4 foram capazes de causar acúmulo de células na fase G2/M do ciclo celular, indicando um mecanismo de ação diferenciado em relação ao composto 2. Esses dados sugerem que os derivados da α-santonina avaliados no presente estudo apresentam um potencial anticâncer, em especial o composto 4 pela moderada toxicidade em PBMC e por ser capaz de induzir uma maior taxa de morte celular via apoptose quando comparado aos demais derivados estudados.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-24T12:33:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) RUBENS RODRIGUES TELES.pdf: 8256916 bytes, checksum: 343eb874fab58d245a7825e979a6bfef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-24T12:33:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) RUBENS RODRIGUES TELES.pdf: 8256916 bytes, checksum: 343eb874fab58d245a7825e979a6bfef (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / CNPQ / Neste trabalho foram estudados parâmetros anisotrópicos de Ressonância Magnética Nuclear, como o acoplamento dipolar residual (do inglês, Residual Dipolar Coupling – RDC) e anisotropia do deslocamento químico residual (do inglês, Residual Chemical Shift Anisotropy), com a finalidade de refinar a elucidação estrutural molecular. A molécula teste escolhida para realização deste estudo foi a α-Santonina, um produto natural com quatro estereocentros, portanto oito diastereoisômeros. Inicialmente, os sinais dos espectros de RMN 1H e 13C foram atribuídos, com auxílio de experimentos uni e bidimensionais. Foram realizados cálculos de mecânica molecular para determinação do espaço conformacional de todos os diastereoisômeros, usando o campo de força MMFF94. As estruturas obtidas, numa janela de 5 kcal/mol foram refinadas com cálculos mecano-quânticos ao nível DFT/B3LYP/6-31G*. As anisotropias do deslocamento químico, foram derivadas do cálculo do tensor de blindagem química calculado com o método GIAO/PBE0/pcS-1. Os meios de alinhamento utilizados foram baseados na metodologia dos géis indutores de alinhamento (do inglês, strain-induced alignment in a gel – SAG), sendo avaliada a eficiência de três meios de alinhamento diferentes: poliacrilonitrila (PAN), poliacrilamida (PH) em DMSO-d6, e polimetilmetacrilato (PMMA) em CDCl3. O experimento realizado com o gel PAN forneceu onze valores de RDC na faixa entre –3,2 e +5,9 Hz. O ajuste dos valores experimentais com as estruturas otimizadas permitiu a determinação da configuração relativa correta da α-Santonina, (5a(S/R), 9b(S/R), 3a(S/R), 3(S/R)), bem como realizar a atribuição dos deslocamentos químicos dos hidrogênios pró-quirais do carbono-5. O experimento usando o gel PH forneceu seis valores de RDC, na faixa de –25,5 a +12,7 Hz. A baixa qualidade dos dados não possibilitou a determinação da configuração relativa da α-Santonina. Por fim, os experimentos com o gel PMMA permitiram a determinação da configuração relativa e da atribuição completa dos sinais de RMN 1H, inclusive dos hidrogênios diastereotópicos H4α, H4β, H5α e H5β que ainda não haviam sido atribuídos na literatura. Foram realizadas medidas de RCSA da molécula teste no gel PMMA. Os valores obtidos ficaram na faixa de –0,05 a +0,01ppm. Com estes dados não foi possível determinar a configuração relativa da mesma. Entretanto, foi realizado um tratamento associando os valores de RDC e RCSA, na qual obteve-se sucesso, chegando à correta configuração relativa com um fator Q igual a 0,606. Nesta amostra foram observados dois sinais para cada carbono, sendo um atribuído à molécula dentro do gel e outro fora do gel. Para estudar esta observação foram realizadas medidas do tempo de relaxação longitudinal, T1, medidas do coeficiente de difusão, bem como imagens de ressonância magnética do tubo de RMN contendo o gel. Foram realizados diferentes cálculos de química quântica para verificar a influência destes no resultado dos valores de RDCs e RCSAs calculados. Para a otimização da geometria foram testadas três classes de métodos, totalizando vinte e oito cálculos. Deste total foram realizados vinte cálculos DFT, quatro cálculos Hartree-Fock e quatro cálculos Semi-empírico. Observou-se que a qualidade da otimização da estrutura não apresentou grande impacto no ajuste dos dados de RDC. Entretanto, a qualidade do ajuste obtido quando foram usados os métodos Semi-empírico foi levemente inferior. Em relação ao RCSA foram testados três níveis de cálculo, PBE0, MP2 e B3LYP, usando sempre o método GIAO. Foi verificada também a importância da inclusão da solvatação implícita com clorofórmio, totalizando nove cálculos. Os resultados mostram que a escolha do método DFT ou MP2 é relevante para os valores calculados de RCSA, por outro lado, a escolha da base e a inclusão da solvatação exerce menor efeito. / In this work we studied the application of anisotropic parameters of Resonance Magnetic Nuclear, namely Residual Dipolar Coupling (RDC) and Residual Chemical Shift Anisotropy (RCSA), to the refinement of molecular structure elucidation. The test molecule chosen for this study was α-Santonin, a natural product with four stereogenic carbons and therefore eight possible diastereoisomeric structures. In the first step, the 1H and 13C NMR spectra were fully assigned by a combination of 1D and 2D experiments. The conformational space of each possible diastereoisomer was explored by means of molecular mechanics computations using the MMFF94 force field. The obtained structures, in an energy window of 5 kcal/mol, were refined at the DFT /B3LYP/6-31G* level method. Chemical shielding anisotropies were derived from chemical shift tensor computations at the DFT GIAO/PBE0/pcS-1 level on the previous B3LYP structures. The alignment media employed in this work used were based on the methodology of straininduced alignment in a gel (SAG). We evaluated the performance of three different gels: polyacrylonitrile (PAN), polyacrylamide (PH) in DMSO-d6, and polymethyl methacrylate (PMMA) in CDCl3. The experiment carried out in PAN gel provided eleven RDC values in the range of –3.2 and +5.9 Hz. Fitting of this experimental values to the computed structures allowed us to determine the correct relative configuration of αSantonin as (5a(S/R), 9b(S/R), 3a(S/R), 3(S/R)), as well as the assignment of chemical shifts of the prochiral hydrogens from carbon-5. The experiment using PH gel provided six RDC values in the range of –25,5 a +12,7 Hz. The lower quality of these data did not allow an unambiguous determination of the relative configuration of α-Santonin. Finally, experiments using the PMMA gel allowed to attribute the relative configuration and the complete assignment of NMR signals, including the diastereotopics hydrogens H4α, H4β, H5α e H5β, that were not assigned before in the literature. We performed RCSA measurements of the test molecule in PMMA gel. The values obtained were in the range of -0,05 a +0,01ppm. It was not possible however to select the correct configuration of αSantonin by fitting these RCSAs to the computed chemical shielding tensors. Nevertheless, when RDC and RCSA values were fitted together the correct structure was selected, arriving to the correct structure with a Q factor equal to 0.606. In this sample was observed two signals for each carbon, being assigned to the molecule within the gel and outside the gel. To further study this behavior were performed measurements of the longitudinal relaxation time (T1), diffusion coefficient and magnetic resonance imaging experiments of the gel. Different methods of quantum chemistry calculations were carried out to evaluate their influence on the outcome of the RDC and RCSA backcalculated values. For the geometry optimization were tested three classes of methods, totaling twenty-eight calculations, twenty DFT based, four Hartree-Fock and four Semiempirical. It was observed that the quality of the structure optimization does not have a strong impact on the fitting of the RDC data. Nevertheless, slightly worse fittings were consistently obtained when using Semiempirical geometries. Regarding the RCSAs we tested three classes of GIAO methods: PBEO, MP2 and B3LYP. It was also evaluated the importance of the inclusion of implicit solvation, totaling nine calculations. The results shown that the choice of DFT or MP2 method is relevant to the RCSA back-calculated values, on the other hand the choice of the basis set or the inclusion of solvation have small effects.